一招搞定qPCR 引物查找

4. 然后在 Gene Deion 那里核对一下基因信息，确定后在几对引物中选择合适的拿去合成。选择标准如下：

首先看看 Amplicon Size，建议在 100~300bp 间比较好扩增；引物长度控制在 20~25bp 较好，而且上下游引物间不要相差超过 5bp；其次再看 Tm 值，60℃左右，相差不要超过 1℃。最后，将选择好的引物进一步验证（可复制粘贴）。

5. 回到 Pubmed，打开里面的 primerblast。网址是：

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi?LINK_LOC=BlastHome） 。

将选中的引物直接复制到相应的位置。

在 Database 里选 Refseq mRNA，在 Get Primer 后的第一个小方框上也打个勾，再点 Get Primer，这样结果就会显示在新的标签页。

接着再在 Database 里选 Genomes for selected organisms（primary referenceassembly only），点击 Get Primer。

得到结果：在 Refseq mRNA 的数据库里面我们得到的就是这对引物能扩增出什么产物来，一看结果都是 ATG7，只是有不同的转录本，扩增产物长度也一样，没关系，反正扩出来都是 ATG7。

在 Genomes for selected organisms（primary referenceassembly only）里查找的目的是看看是否用该对引物会扩增出非特异性的产物，没有是最好的，说明引物很特异；如果有，也不要着急，看看到底扩增出来什么？

如果不是你想要的基因，那么再看看 Product length：1657bp，一般 500bp 就比较难扩增出来了，所以这么长的产物，qPCR 是扩增不出来的。

结合以上判定方法，你选的引物基本上就能跑出漂亮的溶解曲线了，另外需要注意的是，你提取的 RNA 是否合格也非常影响结果。

这种查找 qPCR 的引物的方法既快又准，需要注意的是，blast 真的很慢，如果你对 primer bank 有十足的信心，那么基本不会再借用 blast 来判断你选的引物好不好，结合扩增产物长度、引物长度和 Tm 值就能更快的实现三选一或二选一了！

文章来源：每日生物评论

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