用"OD600"测定微生物生长曲线

如上所述，由于OD600检测的是散射光而不是吸收光，并且吸收光常用的比尔定律描述的是吸光度值与对光有吸收的物质浓度线性关系， 因此比尔定律在理论上并不适用于微生物OD600的检测。然而实践表明，尽管微生物OD600的检测没有光吸收信息，比尔定律仍然适用于低密度微生物。换句话来说，对于低密度微生物悬液，OD600值可以跟微生物细胞数量有直接的换算关系。对于高密度微生物悬液，OD600的测定数据则更像是抛物线形式的。如果想要用OD600的值来反映高密度微生物悬液样品浓度，那么针对不同的微生物，OD600的值和相应的细胞数量都需要做相应的换算校正1。

比色皿还是微孔板？

在对大容量的生物制程进行监测过程中，一般推荐使用比色皿。这种监测，通常需要每隔一定时间（如1小时），测定微生物的生长状况。每次检测需要大约1.5ml微生物悬液，并且检测之前需要一定时间进行样品抽取（如图2）。

图2，酵母培养发酵罐样品抽提

微孔板则主要用于长时间连续监测微生物生长状况。检测过程中，每孔只需200微升悬液，设定相应检测间隔时间，仪器便可自动实时监测微生物生长状况。因为通常所用的微孔板为96孔板，所以这种检测方法非常适合于不同培养基条件或者不同菌株的多样品重复长时间自动监测。

哪些仪器可用？

利用用吸光度功能测定颗粒的散射光，使用不同仪器会有不同结果。原因是不同的仪器使用不同的光束，并且探测器的位置到样品的距离也不同。对于微生物悬液产生的散射光，由于距离样品不同距离的检测器，其收集的散射光信号不同，例如，距离近的检测器可以检测到散射光，距离远的检测器则可能检测不到散射光（如图3）。因此，推荐使用可用OD600来监测微生物生长过程的专用仪器来做此类检测。显然，如果要用比色皿或者微孔板来检测，我们只能选择分光光度计或酶标仪。而可以同时使用比色皿和微孔板来检测的设备，例如BMG SPECTROstar Nano，对于此类应用会是一种更好的选择，可以满足未来所有的实验需求。

图3，不同的设备会有不同检测结果。相同大小的检测器，越靠近微生物样品，越能检测到相应的散射光信号，距离太远的检测器，则检测不到散射光信号

什么时候需要校准？

如果要用OD600来确定溶液中微生物的细胞数量或浓度（细胞数/ml），或者校正OD600散射光测定的非线性问题，那么需要对此方法进行校准。校准过程中，需要先制备已知微生物浓度的微生物悬液，然后在所用仪器上使用与后续实验相同的体积来测定OD600，最后可使用这些测量值制作校准曲线。之后，便可通过未知样本的OD600值，根据校准曲线来测算微生物样品浓度。由于散射光强度会随颗粒大小或形状而改变，所以针对不同的微生物，推荐测定相应的校准曲线来测算微生物样品浓度。同样，当更换分析仪器或者样品体积时，散射光和样品浓度对应的校准曲线也是需要重新测定的。