人胚胎干细胞 (hESC) 的饲养层依赖性培养

2024-07-07 10:29| 来源: 网络整理| 查看: 265

快速链接介绍订购信息需要的材料制备培养基与材料制备 MEF 培养皿hESC 解冻和铺板hESC 传代附录相关产品信息诱导多能干细胞胚胎干细胞KnockOut™ 产品

下载 PDF 文件

介绍

人胚胎干细胞 (hESC) 通常维持在一层失活的鼠胚胎成纤维细胞 (MEF) 饲养层细胞上。hESC 细胞可以在这些条件下维持数代，且不影响细胞的增殖或多能性和分化潜能。本实验方案介绍了 hESC 的饲养层依赖性培养。

返回顶部10828028,10565018,11140050,PHG0264,S1520100 需要的材料 Dulbecco 改良 Eagle 培养基 (D-MEM)（货号 10569-010）经 ESC 验证的胎牛血清 (FBS)（货号 10439-024）含 GlutaMAX™-I 的 D-MEM/F-12 (1X)（货号 10565-018） KnockOut™ 血清替代物 (KSR)（货号 10828-028） MEM 非必需氨基酸溶液，10 mM（货号 11140-050） β-巯基乙醇，1000X（货号 21985-023） Gibco 小鼠胚胎成纤维细胞（经辐照）（货号 S1520-100）• 碱性成纤维细胞生长因子 (bFGF)（货号 PHG0264） GlutaMAX™-I (100X)（货号 35050-079） IV 型胶原酶（货号 17104-019）（用于酶传代）或 StemPro EZPassage™ 工具（货号 23181-010）（用于机械传代）细胞刮刀（Falcon，货号 353085）含钙、镁离子的 Dulbecco's PBS (DPBS)（货号 14040-133）不含钙、镁离子的 Dulbecco's PBS (DPBS)（货号 14190-144）附着因子（货号 S006100）37°C 水浴适当的组织培养板和用品

注：作为含 GlutaMAX™-I 的 D-MEM/F-12 (1X)、KSR 和 bFGF 的替代物，您可以使用 KnockOut™ ESC/iPSC 培养基试剂盒（货号 A1412901）。

返回顶部制备 MEF 培养皿用附着因子 (AF) 溶液覆盖各新培养容器的整个表面，并将容器在 37°C 下孵育30分钟或在室温下孵育1小时。在层流培养罩中采用无菌操作，临用前通过抽吸完全去除培养容器中的 AF 溶液。包被容器可立即使用或在室温下储存不超过24小时。注：在加入细胞或培养基之前，无需洗涤培养表面。开始 hESC 培养或传代前 1-2 天，在附着因子包被培养容器中的 MEF 培养基上接种 30,000/cm2 有丝分裂失活 MEF（见表1）将 MEF 培养皿放入 37°C、5% CO2 培养箱中。注：MEF 培养皿在接种后可使用最长 3–4 天。

表1.失活 MEF 的所需用量

培养容器表面积 (cm2) MEF 的数量最佳用量 (mL) 6孔板10 cm2/孔3.0 × 1052.0 mL/孔12孔板4 cm2/孔1.5 × 1051.0 mL/孔24孔板2 cm2/孔0.8 × 1050.5 mL/孔35 mm 培养皿10 cm23.0 × 1052.0 mL60 mm 培养皿20 cm26.0 × 1054.0 mL100 mm 培养皿60 cm21.8 × 10610.0 mL

图1.附着因子包被培养板上 MEF 培养基中的有丝分裂失活 MEF

放大图像

返回顶部 hESC 解冻和铺板从含有失活 MEF 的培养皿中吸出 MEF 培养基，在接种 hESC 前 3–4 小时向培养皿中加入预热的 PSC 培养基。在含有失活 MEF 细胞的培养皿上标记样品瓶的传代次数、日期和用户姓名首字母。使用金属镊子从液氮储存设备中取出 hESC 样品瓶。注：如果样品瓶从取出至解冻暴露于环境温度超过15秒，则将样品瓶转移至含有少量液氮的容器中。戴手套滚动样品瓶，直至外部无霜。该过程需要约 10–15 秒。将样品瓶浸入 37°C 水浴中，不要浸没瓶盖。轻轻涡旋样品瓶。当仅剩余一块冰晶时，从水浴中取出样品瓶。用 70% 乙醇喷洒样品瓶外部，并将其置于通风橱中。使用 5 mL 无菌移液器，将细胞轻轻移至 50 mL 无菌锥形管中。向 50 mL 锥形管中的细胞中缓慢逐滴加入 10 mL PSC 培养基。添加培养基时，来回轻轻晃动锥形管以混匀 hESC。这可减少细胞的渗透压休克。用 1 mL PSC 培养基冲洗样品瓶，然后加至含有细胞的 50 mL 锥形管中。将细胞悬液转移至 15 mL 锥形管中，然后以 200 × g 离心细胞5分钟。吸出上清液并弃去。根据表2，通过用移液器在锥形管中轻轻上下吹吸细胞数次，将细胞沉淀重悬于足量的 PSC 培养基中。从 MEF 培养皿中吸出用过的 PSC 培养基，并将解冻的集落缓慢加入培养皿中。将培养皿轻轻放入 37°C、5% CO2 培养箱中，然后前后左右快速短距离移动培养皿数次，使细胞分散在培养皿表面。孵育细胞过夜。第二天，使用无菌血清移液器去除用过的培养基及碎片，并将其转移至制备的 MEF 培养皿中。如果主培养皿有问题，您可以使用此培养皿作为备份。根据表2中的用量向每个培养皿中加入新鲜的 PSC 培养基。将两块培养板轻轻放入 37°C、5% CO2 培养箱中过夜。在显微镜下检查细胞，并每天更换两块培养板中用过的培养基。如果对超过一块培养板加料，则为每个孔使用不同的移液器，以降低污染风险。在一周内可能无法观察到集落。

表2.所需的 PSC 培养基用量

培养容器表面积 (cm2) 用量 (mL) 6孔板10 cm2/孔2.0 mL/孔12孔板4 cm2/孔1.0 mL/孔24孔板2 cm2/孔0.5 mL/孔35 mm 培养皿10 cm22.0 mL60 mm 培养皿 20 cm24.0 mL100 mm 培养皿60 cm210.0 mL

图2.在含有 KSR 的 PSC 培养基中的有丝分裂失活鼠胚胎成纤维细胞 (MEF) 饲养层上培养的 H9 hESC

放大图像返回顶部 hESC 传代何时分传细胞

通常，在出现以下情况之一时，分传细胞：

MEF 饲养层已使用2周。 hESC 集落太密集或太大。分化增强。分传比例分传比例可能有所不同，但通常在 1:2 和 1:4 之间。有时，细胞生长速度不同，需要调节分传比例。一般规则是遵循上次分传比例，并根据 hESC 集落的外观调整该比例。如果细胞健康且集落间隔足够，则采用相同的分传比例。如果它们过于密集和拥挤，则提高该比例。如果细胞稀疏，则降低该比例。根据外观，细胞需要每 4-10 天分传一次。 hESC 在用 PSC 培养基处理的 iMEF 培养板中生长良好。惯例是在 hESC 传代之前，准备好新的饲养层培养板。

图3.可供传代的集落。注意集落较大且集落彼此非常靠近。

放大图像

使用胶原酶进行酶传代

您可以通过下述酶法或接下来的章节中介绍的机械方法传代细胞。

从含有失活 MEF 的培养皿中吸出 MEF 培养基，在接种 hESC 前 3–4 小时向培养皿中加入预热的 PSC 培养基。在新的 MEF 培养皿上标记细胞系名称、新的传代次数、日期、分传比例和用户姓名首字母。将培养板放回培养箱中。在解剖显微镜下，从待传代的培养皿中取出分化的集落。用巴斯德吸管从培养皿中吸出用过的培养基。向含有 hESC 的培养皿中加入 IV 型胶原酶 (1 mg/mL) 溶液。根据不同的培养皿尺寸调整 IV 型胶原酶的用量（例如，35 mm 培养皿需要 1 mL IV 型胶原酶）。将培养皿在 37°C、5% CO2 培养箱中孵育 30–60 分钟。请注意，不同批次的胶原酶的孵育时间可能有所不同；因此，需要检查集落以确定适当的孵育时间。注：作为 IV 型胶原酶的替代物，您可以使用浓度为 2 mg/mL 的分散酶，并在 37° C、5% CO2 培养箱中孵育培养皿 2–3 分钟。集落边缘开始脱离培养板时停止孵育（见图4）。

图4.经酶处理后，集落脱离 iMEF 层

放大图像

用巴斯德吸管吸出 IV 型胶原酶溶液。在不扰动附着细胞层的情况下，小心去除胶原酶。向每个培养皿中加入 PSC 培养基。使用 5 mL 移液器上下吹吸，将细胞轻轻吹离培养皿表面。确保轻轻吹吸，以尽量减少气泡的形成。将 hESC 从孔表面取出后，将孔内容物合并至 15 mL 锥形管中。使用 5 mL 移液器，向培养皿中加入 PSC 培养基，洗涤并收集任何残留细胞。吸出培养基和细胞，然后将收集的细胞加入 15 mL 锥形管中。在 15 mL 锥形管中轻轻上下吹吸细胞数次，以进一步打散细胞集落。用移液管小心移取以减少泡沫。注：避免制备单细胞悬液。以 200 × g 离心5分钟，然后从 hESC 沉淀上吸出上清液。用适量 PSC 培养基重悬沉淀（请参见表2）。这取决于分传比例和所用培养皿的数量。用 10 mL 移液器混匀细胞悬液。注意不要使集落过度破碎或在培养基中产生气泡。向每个培养皿中加入适量细胞悬液。将培养皿放回培养箱中。前后左右快速短距离移动培养皿数次，使细胞分散在培养皿表面。过夜孵育细胞，使集落贴壁。每天更换用过的培养基。注：当细胞贴壁培养时，打开和关闭培养箱门时应小心，避免影响细胞在孔表面的均匀分布。使用 StemPro EZPassage™ 一次性细胞传代工具进行机械传代将含细胞的培养皿中的培养基更换为新鲜的 PSC 培养基。在层流罩下打开装有 EZPassage™ 工具的包装，取出工具。一只手握住培养容器，沿一个方向拉动（滚动）EZPassage™ 工具穿过整个培养皿。施加轻柔但稳定的压力，使整个滚轮接触培养皿，并在滚动过程中保持均匀的压力。保持 EZPassage™ 工具平行于第1次运动轨迹滚动，直至覆盖整个培养皿。旋转培养皿 90°，然后按上述步骤重复滚动细胞层。完成后，请丢弃 EZPassage™ 工具，不要重复使用。如有必要，使用细胞刮刀将细胞团从培养板上刮下。使用血清移液器，用培养基冲洗培养皿，使切割的集落悬浮在培养基中。将含有集落的培养基转移到 15 mL 无菌管中。将细胞集落以适当密度接种在已用有丝分裂失活 MEF 铺板的培养皿上。将培养板放入 37°C、5% CO2 培养箱中。轻轻振摇培养板，使细胞均匀分布。

图5.使用 StemPro EZPassage™ 一次性细胞传代工具切割后的集落

放大图像

返回顶部附录在 PSC 培养基中，含 GlutaMAX™-I 的 DMEM/F12（货号 10565-018）可替换为以下替代物： KnockOut™ DMEM/F-12（货号 12660-012）如需使用 KnockOut™ DMEM/F-12 制备 100 mL PSC 完全培养基，请在无菌条件下混合下表中列出的组分

组分储备液浓度最终浓度用量 KnockOut™ DMEM/F-12（货号 12660-012）

—

1X78 mLKnockOut™ SR（货号 10828-028）

—

20%20 mLGlutaMAX™-I（货号 35050-061）200 mM2 mM1 mLMEM 非必需氨基酸溶液（货号 11140-050）10 mM0.1 mM1 mLbFGF（货号 PHG0024）10 μg/mL4 ng/mL40 μLβ-巯基乙醇（货号 21985-023）1000X1X100 μL KnockOut™ DMEM（货号 10829-018）如需使用 KnockOut™ DMEM 制备 100 mL PSC 完全培养基，请在无菌条件下混合下表中列出的组分。

组分储备液浓度最终浓度用量 KnockOut™ DMEM（货号 10829-018）

—

1X78 mLKnockOut™ SR（货号 10828-028）

—

20%20 mLGlutaMAX™-I（货号 35050-061）200 mM2 mM1 mLMEM 非必需氨基酸溶液（货号 11140-050）10 mM0.1 mM1 mLbFGF（货号 PHG0024）10 μg/mL4 ng/mL40 μLβ-巯基乙醇（货号 21985-023）1000X1X100 μL 替代物 bFGF 包装规格

产品名称货号产品规格重组人碱性 FGF (AA 1-155)PHG026410 μg重组人碱性 FGF (AA 1-155)PHG026625 μg重组人碱性 FGF (AA 1-155)PHG0261100 μg重组人碱性 FGF (AA 1-155)PHG02631 mg

用于收获 iPSC 的解离酶/工具

解离酶/工具应用建议浓度 StemPro EZPassage™ 工具（货号 23181-010）手动传代一次性无菌工具StemPro Accutase （货号 A11105-01）传代后形成单层细胞、解离成单细胞1X 即用型（在 37°C 下孵育 1–2 分钟）分散酶（货号 17105-041）传代后形成集落样形态2 mg/mL （在 37°C 下孵育 2–3 分钟）TrypLE™ Express （货号 12604-021）解离成单细胞1X 即用型

返回顶部

仅供研究使用。不得用于人或动物的任何治疗或诊断用途。

MAN0006679 2012年3月5日

【本文地址】

公司简介

联系我们