超临界CO2流体萃取法提取紫杉醇及其伴生物的方法与流程

背景技术：

2.目前，业内常用的现有技术是这样的：环境问题是当今全球广泛关注的重点问题之一。从源头控制污染排放，利用近代先进的技术方法建立和发展无污染的清洁生产技术成为当代工业发展的趋势。在环境教学实验中适当引入一些重要的高档次仪器，建立一些清洁生产技术样板实验，对培养学生了解环境学科的发展很有必要。在复旦大学“三年行动计划”中，对我系“基础教学实验室工程”进行了重点资助建设，选择了“超临界co2流体技术”纳入实验课程建设。超临界流体萃取sfe(supercriticalfluidextraction)是利用处于临界压力和临界温度以上的流体具有特异增加的溶解能力而发展起来的化工分离新技术.由于提取中草药有效成分的传统工艺过程复杂、污染严重，所以sfe用于药物提取受到重视。紫杉醇(taxo1)是一种含于红豆杉属植物茎皮中的具有抗癌活性的二萜类化合物，对kb细胞具有细胞毒性。紫杉醇对乳腺癌、卵巢癌、肺癌、食管癌及结肠癌有良好疗效，1992年，jennings等发现以乙醇为修饰剂的超临界co2。流体能有效提取红豆杉中的大部分紫杉醇，对紫杉醇的选择性也比传统的单纯乙醇提取效果好，后来的一些研究也得到相似的结论。考虑到红豆杉生态环境保护等问题，利用枝叶等可再生资源提取紫杉醇最为可取。3.综上所述，现有技术存在的问题是：传统紫杉醇提取方法繁琐，耗时长。

技术实现要素：

4.针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种超临界co2流体萃取法提取紫杉醇及其伴生物的方法。5.本发明是这样实现的，一种超临界co2流体萃取法提取紫杉醇及其伴生物的方法包括：6.步骤一，选取一定数量的欧洲短叶红豆杉枝叶，通过干燥、粉碎至一定粒度，将粉碎后的红豆杉枝叶颗粒加入超临界流体萃取设备的萃取单元内；7.步骤二，将co2和修饰剂分别由co2泵和修饰剂泵打入各泵的锥形腔体中，再经流体混合器按设定的比例混合后，流入萃取单元中的集流腔；8.步骤三，在达到萃取设定的温度和压力后，萃取单元开始萃取；9.步骤四，动态萃取时，超临界co2流体经限流管流入收集瓶后减压排放，流体带出的萃取所得物则溶于收集液中。10.步骤五，用反相高效液相色谱法(hplc)测定萃取物中的紫杉醇及其伴生物含量，用液质联用(lc/ms/ms)进行产物鉴定。11.进一步，所述欧洲短叶红豆杉枝叶在进行干燥时，利用20～30℃温度的热风进行吹干或进行晒干。12.进一步，所述欧洲短叶红豆杉枝叶粉碎至10～20目，选取的欧洲短叶红豆杉枝叶的重量为80g～150g。13.进一步，所述萃取设定的温度和压力为萃取温度30～45℃，萃取压力30～50mpa。14.进一步，所述萃取单元萃取过程的co2流速为2ml/min。15.进一步，所述动态萃取时间为1～1.5h。16.进一步，所述co2和修饰剂在流体混合器的设定比例为10:1～2，所述修饰剂为体积浓度为60％‑70％的乙醇溶液。17.进一步，所述超临界流体萃取设备包括：18.co2钢瓶、修饰剂容器、流体混合器、萃取单元、限流单元和收集单元；19.所述co2钢瓶、修饰剂容器分别通过co2泵和修饰剂泵与流体混合器连通，所述流体混合器的出液口通过连接管路与萃取单元连通，所述萃取单元通过连接管路与限流单元的限流器连通，所述限流器通过连接管路与收集单元的收集瓶连通。20.进一步，所述萃取单元包括集流腔和萃取池，所述集流腔分别与流体混合器、萃取池和排气阀连通。21.进一步，所述流体混合器与co2泵、修饰剂泵、萃取单元之间分别设置有第一阀门、第二阀门和第三阀门。22.进一步，所述hplc测定条件：柱温为35℃；流动相：甲醇：乙腈：水＝30：30：40(体积比)，流速为1.0ml/min；紫外检测波长227nm；每次进样体积为10ul；用w(紫杉醇)＝99.5％绘制外标工作曲线，对样品进行定量分析；23.质谱分析条件：电喷雾化学解离(esi)：全范围扫描为150‑‑2000，壳气为70单位，辅助气为15单位，源电压为6kv，加热毛细管温度为250℃，蒸发器温度为465℃，质谱流动相为acn：h20＝51：49，流速为0.8ml/min，柱箱温度为40℃，检测波长为227nm.吸光度用i表示，质荷比用m/z表示，质量数丰度用i表示。24.进一步，所述超临界流体萃取设备萃取流程为：co2和修饰剂分别由co2。泵和修饰剂泵打人各泵的锥形腔体中，再经流体混合器按设定的比例混合后，流入萃取单元中的集流腔。在达到萃取设定的温度和压力后，萃取单元开始萃取。动态萃取时，超临界co2。流体经限流管流入收集瓶后减压排放，流体带出的萃取所得物则溶于收集液中。25.综上所述，本发明的优点及积极效果为：本发明利用超临界co2流体萃取法从欧洲短叶红豆杉枝叶中提取分离紫杉醇及其伴生物，用反相高效液相色谱法(hplc)测定萃取物中的紫杉醇及其伴生物含量，并用液质联用(lc/ms/ms)进行产物鉴定。与传统的乙醇三次提取方法相比，超临界流体萃取法流程简单，步骤少，耗时短，废渣无溶剂残留，是一种环境友好的提取方法。附图说明26.图1是本发明实施例提供的超临界co2流体萃取法提取紫杉醇及其伴生物的方法流程图。27.图2是本发明实施例提供的超临界流体萃取设备原理图。28.图3是本发明实施提供的超临界流体萃取设备图。29.图中：1、co2钢瓶；2、co2泵；3、第一阀门；4、修饰剂容器；5、修饰剂泵；6、第二阀门；7、流体混合器；8、第三阀门；9、集流腔；10、萃取单元；11、萃取池；12、限流单元；13、限流器；14、收集单元；15、收集瓶；16、排气阀。30.图4是本发明实施提供的sfe(al—a4)法和传统萃取法(b)提取产物色谱图。31.图5是本发明实施提供的三种主要提取物的分子结构图。32.图6是本发明实施提供的主要提取产物的提取状况图。33.图7是本发明实施提供的正离子全范围扫描质谱图。具体实施方式34.为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。35.下面结合附图对本发明的应用原理作详细的描述。36.如图1所示，本发明实施例提供的一种超临界co2流体萃取法提取紫杉醇及其伴生物的方法包括以下步骤：37.s101，选取一定数量的欧洲短叶红豆杉枝叶，通过干燥、粉碎至一定粒度，将粉碎后的红豆杉枝叶颗粒加入超临界流体萃取设备的萃取单元内；38.s102，将co2和修饰剂分别由co2泵和修饰剂泵打入各泵的锥形腔体中，再经流体混合器按设定的比例混合后，流入萃取单元中的集流腔；39.s103，在达到萃取设定的温度和压力后，萃取单元开始萃取；40.s104，动态萃取时，超临界co2流体经限流管流入收集瓶后减压排放，流体带出的萃取所得物则溶于收集液中。41.s105，用反相高效液相色谱法(hplc)测定萃取物中的紫杉醇及其伴生物含量，用液质联用(lc/ms/ms)进行产物鉴定。42.下面结合实验对本发明的应用原理作进一步的描述。43.本发明提供的仪器与试剂为：44.美国isco公司sfx220型sfe装置，φ(co2)为99.999％；45.美国惠普公司agi1ent1100系列高效液相色谱仪(hplc)，日本shiseido公司capcellpakc18分析色谱柱(4.6mmi.d.×250mm，5um)；46.thermofinnigan公司的lcqadvantagemssysterm，包括tsp高效液相色谱系统和lcqadvantage质谱检测仪，metachem公司的taxsil.3柱(250mm×4.6mm)；47.色谱用甲醇、乙腈为hplc级，水用法国millipore公司的milli.q水纯化系统制备，其他溶剂为分析纯；红豆杉枝叶产地为荷兰，品种为taxusbaccata.将摘取的植物枝叶放人真空烘箱，在50℃下干燥72h，待其烘干后，研磨，得到红豆杉枝叶样品i；w(紫杉醇)＝99.5％.48.本发明提供的hplc测定条件：柱温为35℃；流动相：甲醇：乙腈：水＝30：30：40(体积比)，流速为1.0ml/min；紫外检测波长227nm；每次进样体积为10ul；用w(紫杉醇)＝99.5％绘制外标工作曲线，对样品进行定量分析；49.质谱分析条件：电喷雾化学解离(esi)：全范围扫描为150‑‑2000，壳气为70单位，辅助气为15单位，源电压为6kv，加热毛细管温度为250℃，蒸发器温度为465℃，质谱流动相为acn：h20＝51：49，流速为0.8ml/min，柱箱温度为40℃，检测波长为227nm.吸光度用i表示，质荷比用m/z表示，质量数丰度用i表示。50.如图2所示，本发明提供的超临界流体萃取设备萃取流程为：co2和修饰剂分别由co2泵和修饰剂泵打人各泵的锥形腔体中，再经流体混合器按设定的比例混合后，流入萃取单元中的集流腔。在达到萃取设定的温度和压力后，萃取单元开始萃取。动态萃取时，超临界co2流体经限流管流入收集瓶后减压排放，流体带出的萃取所得物则溶于收集液中。所用设备外观如图3。51.1、结果与讨论52.1.1超临界co2流体萃取法53.取3g枝叶样品在27.6mpa，40c进行超临界co2流体萃取。因为超临界co2流体对极性较强的物质溶解能力较差，加入少量第二组分溶剂可大大增加其溶解能力，这种溶剂称为助溶剂，也称夹带剂或修饰剂。本实验以甲醇为吸收液，分别采用不加修饰剂和加不同修饰剂进行实验。每20rain收集1次，将收集液定容后检测其中的紫杉醇含量。萃取率如表1所示：54.表1不同修饰剂条件下的萃取率[0055][0056]1.2传统有机溶剂萃取法[0057]从红豆杉枝叶树皮中提取紫杉醇有机溶剂萃取法有多种，本实验采用的叫w(c2h5oh)＝95％浸提法是最常用的方法之一.取500g枝叶样品i用乙醇(95％)浸提24h，滤余物用乙醇(95％)继续浸提，共浸提3次.各次浸提液合并后在真空条件下旋转蒸发浓缩至原来体积的2％，然后加入与浓缩液等体积的ch2c12混合，再加与混合液等体积的水进行萃取，共萃取3次.ch2c12层合并用水洗2次后浓缩，于50℃真空干燥2h后检测其中的紫杉醇含量.[0058]1.3sfe与传统提取法提取产物的分析对比[0059]实验提取产物色谱图如图4所示。a1一a4分别为sfe法20—40、40—60、140—160、160—180rain时收集液的色谱图，b为传统有机溶剂萃取物的色谱图，①号峰为紫杉醇。从图中可以看出，在sfe法和乙醇(95)浸提法中，紫杉醇都被明显提取。[0060]1.4主要提取产物的得率[0061]传统提取法和sfe法除了提取出紫杉醇(taxo1)外，还有两种主要的提取产物：10‑去乙酰基巴卡亭ⅲ(10‑dab111)和紫杉碱b(taxineb)，即图4中的②、③号峰。它们的分子结构如图5所示。[0062]这三种提取物的提取率如图6所示。由图可以看出三种主要提取物在sfe法的不同馏分中含量不同，相比传统提取法，实验材料用量小的情况下，sfe法可以实现对三者的粗步分离。且sfe提取法对10‑dabⅲ和taxineb的提取效果比传统提取法高得多。各提取产物的回收率对比见表2。[0063]表2三种主要提取产物的回收率[0064][0065]1.5主要提取产物的质谱分析[0066]对①号峰进行分析得到质谱图7(a)。可以看到在实验条件下，主要是m/z＝876.2的[m+na]+离子和m/z＝1729.2的[2m+na]+离子，其他强度较小的峰主要是紫杉醇解离后得到的碎片离子。因而可以证实，①号峰确实是紫杉醇。同样对②、③号峰进行分析，得质谱图7(b)和7(c)，证实②、③号峰分别是1o‑dabm，taxineb。[0067]sfe法与传统有机溶剂浸提法相比较，萃取效果好，能实现产物的粗步分离，而且sfe法流程简单、步骤少、耗时短，省去了一些分离精制步骤，提取周期短，效率高；废渣无溶剂残留，能最大程度保持各组分的原有特性；只对溶质起作用，不改变溶质之外的任何成分，不产生新的三废物质，对环保有利。[0068]以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。