鸡粪和猪粪生物发酵过程中抗生素抗性基因的动态变化

抗生素可促进动物生长, 同时在预防和治疗动物传染性疾病等方面发挥着重要作用[1].据估计, 每年用于养殖业的抗生素占年总产的46.1%[2].由于动物肠道对抗生素的吸收较差, 30%~90%的抗生素通过动物排泄进入环境中[3].细菌在抗生素的诱导下, 产生各种抗生素抗性基因[4](antibiotic resistance genes, ARGs).随着我国畜禽养殖业的快速发展, 畜禽粪便产生量逐年上升.由于畜禽粪便中含有氮、磷和钾等养分资源, 替代化肥潜力巨大, 常作为一种有机肥施入土壤[5], 粪便中所携带的抗生素和ARGs也随之进入环境.细菌中所携带的ARGs可通过质粒、转座子和整合子等可移动遗传元件(mobile genetic elements, MGEs)在细菌的种内和种间发生水平转移(horizontal gene transfer, HGT), 加速了ARGs在环境中的传播和扩散[6].许多研究表明, 长期施用畜禽粪便后, 农田土壤中ARGs的多样性和丰度均显著增加[7~10].据统计, 我国每年畜禽粪污产生量高达38亿t, 但综合利用率不足60%[11].因此, 对畜禽粪便应进行无害化处理后再施入土壤不仅可以实现畜禽粪便的资源化利用, 还可有效减少ARGs在环境中的传播.

堆肥是目前应用较广的一种畜禽粪便处理方式, 具有环境友好、能耗低和成本效益高等优点[12].畜禽粪便堆肥一方面可以降解大部分抗生素[13], 另一方面可通过高温杀灭粪便中的病原菌和耐药微生物, 通过改变微生物群落结构和组成, 进而影响ARGs丰度和多样性[14], 从而有效缓解粪便中抗生素和抗性基因的复合污染[15].不同类型的畜禽粪便, 抗生素含量和ARGs丰度存在较大差异[16].Hou等[17]和Zhao等[18]的研究发现鸡粪和猪粪中的抗生素残留量远大于牛粪, 鸡粪中检出的抗生素种类繁多且量大, 喹诺酮类抗生素高浓度富集.这是由于鸡和猪的养殖密度大, 出栏期短, 需要频繁使用抗生素来防治疾病和促进生长, 因此养鸡场和养猪场抗生素的使用量远大于养牛场[19].钱勋[19]通过对不同粪便中的ARGs检测发现, 鸡粪中检出的ARGs种类最多且丰度最高, 多重耐药ARGs的比例显著高于猪粪.因此, 探究堆肥过程中鸡粪和猪粪中ARGs的削减差异及其影响因素, 分析ARGs和MGEs与细菌群落的关系, 探索促进好氧堆肥对ARGs消减效果的条件, 不仅可为监测评价畜禽粪便及其堆肥产物的生态风险提供参考, 也可为优化堆肥条件削减畜禽粪便中的ARGs提供理论依据, 进而最大限度降低其传播扩散风险.

微生物是堆肥过程中的关键驱动因子, 其种类、数量和活性影响着物质的分解和转化, 向堆体中添加促腐微生物菌剂可通过调节微生物种群结构及活性, 有效提高堆肥效率和加速腐熟[20, 21].本研究以浙江省海盐县某集约化养殖场的新鲜鸡粪和猪粪为原料, 接种微生物促腐剂进行条垛式高温好氧腐熟堆肥.利用荧光定量PCR技术检测了堆肥的不同阶段两种堆体中ARGs和MGEs丰度的动态变化, 主要考虑了在畜禽养殖业中检出率较高的10种ARGs[tetB(P)、tetG、tetL、tetM、tetO、tetT、aacA、aadD、aphA3、sat4]和7种MGEs(intI1、ISEcp1、IS6100、IS26、IS1216、IS613、tnp614)[7], 同时采用高通量测序技术测定细菌群落结构; 并进一步分析了ARGs和MGEs与细菌群落的相关性和堆肥理化性质(温度、含水率、pH和DOC)对ARGs和MGEs的影响, 以期为畜禽粪便无害化处理与资源化利用提供理论依据.

堆肥原料来源于浙江省海盐县某集约化养殖场的新鲜鸡粪和猪粪.在浙江省海盐县友邦生物肥料有限公司进行堆肥实验, 粪便(鸡粪或猪粪)、米糠和菌剂分别为10 t、1.6 t和18 kg, 堆体为常规条垛, 基本保持同高同宽(高1.0 m, 宽2.0 m).堆体分别为新鲜鸡粪+米糠+菌剂(CM)和新鲜猪粪+米糠+菌剂(PM).本实验所用菌剂为酵素菌速腐剂, 购自淮安大华生物科技有限公司.堆肥实验进行75 d, 堆肥的一次发酵期(1~28 d)每2~3 d翻堆一次, 后熟期(45~75 d)每7~10 d翻堆一次.堆肥实验自2019年9月19日至2019年12月3日进行, 在堆肥过程中第0、3、7、10、14、21、28、45、60和75 d分别采400 g左右堆肥样品, 即一次发酵期每周1~2次采样, 在第28 d取样后堆肥转入后熟期, 后熟期一个月两次采样.实验组堆体设置4个采样点, 采样前搅拌均匀, 里外混合.且1号和3号采样点同位于堆体一侧, 2号和4号采样点同位于堆体另一侧.采样后将样品分为两份, 一份置于4℃冰箱中保存用于理化性质分析, 另一份放入实验室冰箱-20℃冷藏保存, 用于ARGs、MGEs、16S rRNA丰度和细菌群落结构的测定.

温度测定：堆肥期间每天10:00和16:00在样品中心及两侧位置记录堆肥温度, 取平均值记为当日温度, 同时记录当日环境温度.

pH值测定：按新鲜堆肥样品质量与超纯水体积为1∶10 (g∶mL)混合均匀后置于水平振荡仪上振荡1 h, 取下后静置30 min后测定.

含水率：采用烘干法测定, 将铝盒洗净烘干至恒重后称取空铝盒重量记为W0, 称取约5 g(精确至0.001 g)在4℃条件下保存的新鲜堆肥样品, 平铺放置于空的铝盒中, 称重记为W1, 放置于已预热至105℃±2℃的电鼓风恒温干燥箱进行烘干处理, 恒重后移入干燥器中待平衡30 min后取出样品称重, 记为W2.堆肥中含水率=(W1-W2)/(W1-W0)×100%.

DOC：将堆肥样品按风干后的物质重量与超纯水体积为1∶10(g∶mL)加入超纯水, 室温条件下170r·min-1水平振荡提取1 d, 然后在4℃, 10 000 r·min-1下离心20 min, 上清液过0.45 μm的滤膜, 滤液在TOC分析仪(耶拿, MULTI N/C 2100, 德国)测定滤液中水溶性有机碳DOC浓度, 并计算单位重量堆肥干物质中DOC的含量.

各样品称取0.5 g, 按照Fast DNA Spin Kit for feces(MP Biomedicals, Santa Ana, CA, 美国)试剂盒步骤提取堆肥样品总DNA, 利用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测DNA浓度和纯度, 置于-20℃冰箱保存.

采用实时荧光定量PCR仪(BIO-RAD, 伯乐)进行定量PCR反应, 将含有目标基因的质粒DNA依次进行10倍梯度稀释, 建立标准曲线, 超纯水作为空白.样品在96孔板中进行测定, 采用20 μL反应体系进行反应：超纯水7.6 μL, TB Green Ⅱ(Takara, 日本) 10 μL, 上下游引物各0.2 μL, DNA模板2 μL.利用TB Green Ⅱ与双链DNA结合所发出的荧光信号监测扩增过程, 扩增效率控制在90%~110%之间, 然后通过Ct值(扩增循环次数)和标准曲线对样品中DNA的起始浓度进行定量检测, 最终计算平均值.同时对16S rRNA基因进行定量分析以校正细菌丰度和DNA提取效率差异引起的丰度差异.在qPCR检测中所用的10种ARGs和7种MGEs引物信息见文献[22].

高通量测序技术可获得微生物群落在数量和结构方面的信息, 分析微生物群落结构的动态变化.本实验将样品交予北京诺禾致源公司进行16S rRNA基因测序.选用16S rRNA V3~V4区引物341F/806R对细菌DNA进行扩增, 利用TruSep® DNA PCR-Free Sample Preparation Kit建库试剂盒进行文库构建, 构建好的文库经过Qubit和Q-PCR定量, 文库合格后, 使用NovaSeq 6000进行上机测序.测序得到的原始数据进行拼接、过滤和嵌合体去除等步骤后得到最终的有效数据, 然后利用Uparse算法对有效数据进行聚类, 默认以97%的一致性将序列聚类成为OTUs(operational taxonomic units), 并对每个OTUs序列的代表性序列进行物种注释分析, 设定阈值为0.8~1, 获得每个分类水平下的物种丰度信息.

数据采用Microsoft Excel 2016和SPSS 13.0进行数据处理和分析, Origin 8.5进行作图.Spearman相关分析确定ARGs、MGEs和细菌群落之间是否具有显著相关性(|r|>0.7, P < 0.05), 基于相关性数据采用Gephi软件进行网络可视化.采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)进行差异性分析(P < 0.05), Canoco 5.0软件进行冗余分析(RDA), 使用R语言的vegan包进行方差分解分析(VPA).

温度是好氧堆肥的一个重要参数, 通常用于指示微生物活性及堆肥成熟度[23].由图 1(a)可知, 两种堆体温度均呈现先上升后下降的变化趋势, 最终趋于环境温度.在0~7 d, 堆体迅速升温, 第7 d达到峰值, 分别为69.3℃和68.7℃.其原因是在这一阶段好氧微生物大量生长繁殖, 快速利用分解物料中的糖、氨基酸、蛋白质等可降解有机物, 释放热量, 从而快速提高堆体温度.随着堆肥的进行, 堆体中可利用物质逐渐减少, 同时高温也对微生物活性产生抑制作用, 使得微生物活性降低, 产热减少, 因此温度逐渐下降.第3~45 d, 堆体温度均达到55℃以上.

pH对微生物生命活动的主要作用在于引起细胞膜电荷的变化, 从而影响对营养物质的吸收[24].堆肥过程中, pH总体呈现先升高后降低的趋势[图 1(b)].pH在CM中从7.69上升至8.04, 在PM中从7.03上升至8.44.pH在6.7~9.0时, 堆肥过程中微生物均能保持较好的活性[23].pH的升高可能是由于氨氮的生成和积累引起[25].随着堆肥的进行, 物料中的蛋白质经过脱氨基作用产生大量的NH3, 释放后引起了堆体pH的升高, 堆肥后期, 可降解的有机物减少, 微生物代谢活动降低, 氨化作用减弱, 以及在堆肥后期硝化菌的硝化作用产生的H+均造成pH的下降[26].

堆肥中, 水分主要起到溶解有机质、参与微生物代谢和通过水分蒸发带走热量的作用.由图 1(c)可知, 两种堆体含水率呈现逐渐下降的趋势, 其原因是堆肥翻堆发酵时, 随着堆肥温度的快速升高, 水分蒸发损失, 同时又因堆肥物料翻抛损失一部分.随着水分含量的降低, 分解速率也会降低[23].

有机质是微生物赖以生存和繁殖的重要因素.堆肥中, DOC的变化均呈现先升高后降低最后趋于平稳的趋势[图 1(d)].在0~7 d, DOC的浓度呈现逐渐增加的趋势, 其原因可能是在堆肥初期, 部分有机质分解后转化为大量的可溶性碳源物质, 使得DOC的浓度有所提高.随着堆肥中微生物的大量繁殖, DOC又被微生物利用而逐渐减少.

本研究所测定的ARGs主要有3种抗性机制：外排泵(tetG和tetL)、细胞保护[tetB(P)、tetM、tetO和tetT]和抗生素失活(aacA、aadD、aphA3和sat4).结果表明, 堆肥前, PM中的ARGs的相对丰度是CM的5倍, 显著高于CM(P < 0.05, 图 2).而钱勋[19]的研究结果表明鸡粪中ARGs高于猪粪, 这可能与不同养殖场的养殖条件(饲料和抗生素使用)、动物亚种和动物年龄等不同有关.在CM中, 外排泵类ARGs(tetG和tetL)的相对丰度最高, 其中tetG的相对丰度最高.在PM中则是细胞保护类ARGs[tetB(P)、tetM、tetO和tetT]相对丰度最高.这可能与鸡和猪消化方式、饲料结构和肠道微生物等存在明显不同有关.Cheng等[27]分析了浙江杭州不同规模的养猪场、养鸡场、养鸭场和养羊场的粪便中抗性基因的相对丰度, 结果表明, 养鸡场、养鸭场和养猪场ARGs明显高于养羊场(P < 0.05), 这可能是因为相较养羊场, 其他类型养殖场的养殖密度较大, 使得抗生素的使用量相应增加.Zhao等[4]的研究也发现, 养殖中使用抗生素和金属作为饲料添加剂, 影响了猪肠道微生物群组成, 显著提高了猪肠道中ARGs的多样性和丰度, 加剧了ARGs的富集.

随着堆肥过程的进行, 在CM和PM中, tetG在堆肥后期呈增加趋势, 其余ARGs均呈现逐渐减少的趋势, ARGs总相对丰度呈现先减少后逐渐上升的趋势, 部分ARGs表现出一定的波动性(图 2).Zhang等[28]研究污泥堆肥过程时也发现tetG出现富集.Selvam等[29]的研究发现, 堆肥物料中的抗生素浓度会造成堆肥过程中细菌群落的波动, 而作为ARGs的主要携带者, 细菌群落的改变会直接影响ARGs的丰度.堆肥结束后, 在CM中, tetM、tetT和aacA这3种基因的消减率均达到99%, 其余ARGs的消减率均达到85%以上.在PM中, 除tetG外, ARGs的消减率均达到99%以上.这表明好氧堆肥的高温阶段能有效去除多种ARGs.当温度达到55℃持续3 d时可以更有效地破坏细菌宿主和质粒, 并在嗜热阶段去除大多数ARGs, 其原因可能是一方面高温可以有效破坏携带ARGs的宿主细菌和质粒[29], 另一方面高温可大幅减少质粒的结合, 抑制了水平基因转移的过程[30].

为进一步探究堆肥过程中ARGs的变化趋势, 对两种堆体ARGs和16S rRNA的绝对丰度变化进行比较(图 3).由图 3(a)和图 3(b)可知, 堆肥结束后, 除tetG外, ARGs的绝对丰度均明显降低.CM和PM中, tetG的绝对丰度从堆肥初期到高温期逐渐降低, 而在高温期过渡到腐熟期时出现回升的现象.堆肥结束后, CM和PM中tetG的绝对丰度从1.29×1011 copies·g-1和1.87×1011 copies·g-1增至5.68×1011 copies·g-1和6.04×1011 copies·g-1.由图 3(c)可知, 堆肥前, CM中16S rRNA的绝对丰度高于PM.虽然两种堆肥的原料中均添加了菌剂促进腐熟, 但其添加量很低, 仅为0.16%, 对堆肥的16S rRNA的影响较小.堆肥结束后, CM中的16S rRNA的绝对丰度从最初2.50×1012 copies·g-1降至1.37×1012 copies·g-1; PM从最初的1.87×1012 copies·g-1降至1.48×1012 copies·g-1.由此可见好氧堆肥对CM中细菌的影响大于PM.

质粒、转座子和整合子等MGEs在细菌间通过接合、转化和传导等方式交换所携带的抗性基因.这些MGEs是ARGs水平转移的重要载体, 其水平转移是促进ARGs传播扩散的主要机制[31].整合子是水平基因转移的重要指标, 其中Ⅰ类整合子(intI1)是环境中较为常见的整合子之一[32].有研究表明, Ⅰ类整合子(intI1)作为捕获和整合ARGs的可移动遗传因子, 对ARGs的转移有重要影响[33].本研究检测了intI1、IS6100、IS613、IS1216、IS26、ISEcp1和tnp614共7个MGEs在堆肥过程中的相对丰度变化.由图 4可知, 堆肥前, PM中MGEs的相对丰度是CM的7倍, 显著高于CM(P < 0.05), 表明猪粪的抗性基因污染潜力显著高于鸡粪.与Wu等[34]的研究结果相似, IS6100和intI1是丰度较高的两种MGEs.在CM中, IS6100的相对丰度最高; 在PM中, intI1的相对丰度最高.

随着堆肥的进行, 除intI1和IS6100外, 两种堆体中的MGEs的相对丰度呈现逐渐减少的趋势[图 4(a)和4(b)].在第3 d, MGEs相对丰度显著降低(P < 0.05), 且后期未出现明显反弹.堆肥结束时, CM中, IS26的去除率达到90%, ISEcp1、IS1216、IS613和tnp614的去除率均达到99%.PM中IS613的去除率达到90%, ISEcp1、IS26、IS1216和tnp614的去除率均达到99%.这一结果表明, 好氧堆肥的高温过程可以有效去除鸡粪和猪粪中的大部分MGEs. Su等[35]的研究表明, MGEs的去除可能与污泥堆肥过程中宿主细菌群落的变化有关, MGEs和ARGs的有效衰减可能是高温阶段温度升高和好氧条件的共同作用下破坏了嗜温和厌氧细菌的结果.

IS6100和intI1的相对丰度在堆肥前后总体呈现增加的趋势.堆肥结束后, 与堆肥前相比, CM和PM中的MGEs均显著增加(P < 0.05), 分别增加了21.8倍和3.1倍.在CM中, 随着堆肥的进行, MGEs呈现逐渐增加的趋势[图 4(c)].45 d前, 其增加趋势较为平缓, 45 d后, MGEs丰度剧增, 后期缓慢增加, 这种趋势主要由intI1的变化引起.与CM不同, 在PM中, MGEs的丰度随着intI1的变化呈现出一定的波动性[图 4(d)]. 0~10 d, intI1相对丰度逐渐增加, 10~21 d, 可能由于堆体持续高温, 破坏了宿主细菌[29], 其丰度显著下降(P < 0.05), 21 d出现明显反弹, 丰度逐渐增加.这一结果与Wu等[34]的研究结果相似, 在猪粪+玉米秸秆的好氧堆肥过程中, intI1和IS6100持续高丰度存在.因此, 常规堆肥对intI1和IS6100的去除效率不佳, 施用于农田土壤后, 这两种基因在环境中的传播风险可能更高[36, 37].

堆肥过程中CM和PM的细菌群落结构在门分类水平上的变化如图 5(a)所示.在CM和PM的堆肥过程中, 厚壁菌门(Firmicutes)和放线菌门(Actinobacteria)为整个堆肥过程中的优势菌门, 在堆肥过程中占主导地位.在不同的堆肥时期, 各细菌门类有不同的变化趋势.在0~21 d, 厚壁菌门为绝对优势菌门, 相对丰度最高, 这可能是由于厚壁菌在高温期可以形成耐热孢子以抵抗高温[38], 同时可以分解纤维素进行各种代谢活动[39]. 21 d后, CM和PM中的厚壁菌门相对丰度显著下降(P < 0.05), 放线菌门的相对丰度呈现逐渐上升的趋势, 在堆肥后期占主导地位.这可能是由于随着堆肥的进行, 堆体含水率逐渐降低, 而放线菌能在含水率降低的环境中形成孢子得以存活[39].放线菌在堆肥后期发挥着重要作用.一方面放线菌能降解难降解的化合物, 有利于堆肥过程中有机质的分解[40]; 另一方面放线菌可以通过分泌各种抗生素抑制病原微生物[41], 有利于堆肥产品病原菌数量的降低[42].

属水平的细菌群落变化情况如图 5(b)所示.CM和PM在属水平上的细菌群落组成存在一定差异.堆肥初期, CM中的优势菌属为Bacillus和Oceanobacillus; PM中的优势菌属为Clostridium_sensu_stricto_1和Bacillus. Bacillus属于厚壁菌门, 高温促进其大量繁殖[43], 使其成为优势菌属.同时Bacillus在堆肥嗜热期可有效促进有机类物质的降解, 在一些富含木质素和纤维素的堆体中促进可溶性有机碳的降解[43], 还可以通过降解有机酸, 分泌蛋白水解酶促进蛋白分解提高pH[44]. Clostridium_sensu_stricto_1作为来自动物肠道的微生物经堆肥处理后相对丰度下降, 这与蔡涵冰等[45]的研究结果一致. 21 d后, CM和PM中的优势菌属Bacillus的相对丰度显著降低(P < 0.05), 细菌群落结构发生了明显变化. Actinomadura、Saccharomonospora和Glycomyces成为CM和PM堆肥后期的优势菌属. Actinomadura 被认为与有机物的周转相关, 可以广泛降解纤维素和木质纤维素残留物[46]. Saccharomonospora被认为具有将酚类化合物水解成无毒形式的能力[39], 有利于形成无植物毒性的堆肥产品.

为探究细菌群落与ARGs和MGEs之间的关系, 基于Spearman分析, 进行网络可视化(图 6).结果表明, 不同ARGs之间存在协同性, 细胞保护类ARGs[tetB(P)、tetM、tetO和tetT]与抗生素失活类ARGs(aacA、aadD、aphA3和sat4)相互之间呈显著正相关(P < 0.01), 这是由于这些ARGs具有相同的宿主.在CM中, tetL、tetB(P)、aphA3和aacA是连接度较高的ARGs, 分别与7、6、6和6个菌属呈显著正相关; 在PM中, sat4、aphA3、tetT、tetB(P)和tetO是连接度较高的ARGs, 分别与9、9、7、7和7个菌属呈显著正相关, 这表明这些ARGs可能有多个潜在宿主.在CM和PM中, 厚壁菌门是连接度较高的细菌菌门, 与多个ARGs呈显著正相关, 表明厚壁菌可能是多个ARGs的潜在宿主.同时, 由图 6可知, 在CM中, tetG与放线菌门下的Actinomadura、Saccharomonospora呈显著正相关, intI1与Saccharomonspora呈显著正相关.在PM中, tetG和intI1均与变形菌门(Proteobacteria)下的Pseudomonas呈显著正相关.这表明这些菌属可能是tetG和intI1的潜在宿主.结合图 5可知, 堆肥后期放线菌门和变形菌门的丰度均增加, Actinomadura和Saccharomonospora成为CM中的优势菌属, 这可能是堆肥后期tetG和intI1丰度增加的原因之一.

intI1可通过插入序列共同区(ISCR)介导ARGs的捕获和传播, 因此被认为是ARGs传播的一个重要途径[47].Guo等[48]对添加竹炭和竹醋液的猪粪进行好氧堆肥的实验结果表明, intI1与所研究的ARGs(tetW、tetM、tetX、tetG、sul1、sul2、drfA7、ermQ、ermF、ermX和gryA)显著相关(P < 0.01).但是, 本研究中, intI1与除tetG之外的ARGs无显著相关性(P>0.05), 武晋萍等[49]对鸡粪与中药渣共堆肥的研究结果也表明intI1与所研究的ARGs(tetG、tetH、tetM、tetQ、tetR、tetW、aacA、aacC2、aadE、aphA3、lnuA-01、lnuB-01、lnuB-02、mel、blaPSE、blaTEM、blaOXA1、blaOXA30、qnrD、sulⅠ和sulⅢ)之间关系不明显.这可能是由于堆肥体系中原料、微生物群落结构、体系参数和工艺条件不同而造成ARGs传播条件不同[50].因此, 在不同堆肥体系中, intI1和ARGs之间的关系以及ARGs的转移机制还有待进一步探究.

本研究采用冗余分析(RDA)进一步探究堆体中含水率、pH、温度和DOC这4个理化性质与ARGs及MGEs丰度的相关关系(图 7).结果表明, 在CM和PM中, 理化性质分别可解释92.0%和83.5%的ARGs和MGEs差异.含水率对堆肥过程中ARGs和MGEs差异的解释率最高, 分别为39.98%和38.98%.其次是pH, 解释率分别为34.78%和28.86%.

目前关于影响堆肥的主要因素尚无定论.Wang等[51]认为温度是破坏耐药细菌和ARGs的关键因素, 可通过影响有机物分解、抗生素去除和微生物代谢, 影响畜禽粪便堆肥过程中ARGs和MGEs的去除.因为高温可提高嗜温菌和嗜热菌的生物活性, 促进抗生素的生物降解, 同时还可能促进抗生素的水解, 使抗生素浓度降低, ARGs的选择性压力随之减弱[52, 53].但也有研究认为, 相较温度, 控制畜禽粪便好氧堆肥过程中的pH和水分含量更为重要[54, 55].

水分作为运输营养物质的重要介质, 通过影响微生物的代谢活动和抗生素去除, 对ARGs的去除起着关键作用[56].由图 7可知, 在本研究的堆肥体系中, 含水率与大部分ARGs和MGEs均呈正相关, 表明堆肥中含水率的降低有利于ARGs和MGEs的去除.Zhang等[57]的研究也发现水分是影响畜禽粪便好氧堆肥的重要环境因素, 与抗生素浓度显著相关.过低的含水率会限制微生物代谢活动, 抗生素等有机物难以分解; 过高的含水率则会因孔隙积水, 氧气难以传递扩散到堆肥基质中, 透气性降低, 形成厌氧环境, 产生臭味, 导致堆肥质量低下[58, 59].同时Song等[60]的研究表明高含水率可能会促进ARGs的增殖或随水迁移.Liang等[58]通过测定污泥好氧堆肥过程中微生物活性发现, 水分含量对微生物活性的影响大于温度, 这可能是含水率对堆肥过程中ARGs和MGEs差异的解释率高于温度的原因之一.

pH是影响微生物活性的一个重要因素, 不适宜的pH会降低或抑制微生物的活性, 导致堆肥有机物降解缓慢[55].有研究表明pH会影响DNA螺旋的稳定性[61], 从而影响ARGs的去除.图 7中, pH与tetG、intI1和IS6100的夹角均为锐角, 呈正相关, 但与其他ARGs或MGEs均呈现负相关关系, 表明堆肥过程中pH的升高可能促进了多数ARGs和MGEs的去除.Peng等[1]的研究也发现鸡粪堆肥过程中高pH下ARGs的去除效果更好.这可能是由于高pH可对微生物施加选择性压力, 不耐碱的宿主被灭活.Huang等[62]发现碱性发酵可有效减少污泥中ARGs的数量, 这是由于碱性条件导致一些携带ARGs的宿主的凋亡, 同时污泥中遗传载体(质粒DNA、胞外DNA和噬菌体DNA)数量也减少, 碱性pH显著降低了Zeta电位, 导致细菌接合困难, 这可能会限制ARGs接合、转化和转导的转移.因此, 在堆肥过程中可以通过优化工艺参数, 调节堆肥过程中的环境因子, 从而高效去除畜禽粪便等有机废弃物携带的ARGs, 减少有机肥还田的二次污染和生态风险.

为进一步研究ARGs丰度变化的主要原因, 通过方差分解分析(VPA)研究环境因子、细菌群落和MGEs对ARGs的影响(图 8).结果表明, 在CM和PM中, 环境因子、细菌群落和MGEs对堆体中ARGs变化的共同解释量分别为84.23%和68.02%.这表明环境因子、细菌群落和MGEs均为导致ARGs变化的因素, 三者共同作用影响着ARGs的变化.

(1) 猪粪(PM)中ARGs和MGEs相对丰度显著高于鸡粪(CM), 分别是鸡粪的5倍和7倍; CM中tetG、tetL、aphA3和IS6100的相对丰度较高, PM中tetM、tetG、tetL和intI1的相对丰度较高.

(2) 堆肥可有效降低鸡粪和猪粪堆体中9种ARGs和5种MGEs的相对丰度, 9种ARGs总相对丰度消减率分别达到85%和99%以上; 5种MGEs消减率均达到90%以上.其中, 鸡粪中3种ARGs(tetM、tetT、aacA)和4种MGE(ISEcp1、IS1216、IS613、tnp614)的去除率达到99%; 除tetG外, 猪粪中9种ARGs及4种MGEs(ISEcp1、IS26、IS1216和tnp614)去除率达到99%.好氧堆肥对鸡粪和猪粪中的tetG、intI1和IS6100的去除效果较差, 且丰度增加, 可能是因为其宿主细菌对堆肥环境的变化耐受性较高, 针对这些基因需要进一步研究其堆肥消减措施.

(3) 堆肥过程中鸡粪和猪粪细菌群落结构变化显著, 厚壁菌门(Firmicutes)和放线菌门(Actinobacteria)是优势菌门, 相关性分析结果表明, 堆肥过程中去除率高的基因与厚壁菌门相关, 而堆肥后期丰度增加的基因tetG和intI1与放线菌和变形菌显著相关, 暗示堆肥后期放线菌和变形菌丰度增加可能是导致这2种基因丰度增加的原因之一.

(4) 鸡粪和猪粪好氧堆肥过程中, 堆体的温度可在60℃以上保持25 d, 含水率持续下降, RDA分析表明含水率和pH是影响ARGs和MGEs相对丰度变化的关键环境因子.在CM和PM中, 环境因子、细菌群落和MGEs对堆体中ARGs变化的共同解释量分别为84.23%和68.02%, 表明环境因子、细菌群落和MGEs均为导致ARGs变化的因素, 三者的共同作用影响着ARGs的变化.