Gsα在肥厚心肌中的表达及敲除后对心脏发育的影响

心肌肥厚是心衰发生、发展的重要生理病理过程，分为生理性/代偿性肥厚以及病理性肥厚[1]。一般认为生理性肥厚可逆转，是心肌对负荷增加的代偿，病理性心肌肥厚会经历代偿性肥厚过程，但最终会发展为失代偿而发生心衰、心律失常，甚至死亡[2]。Gsα由GNAS基因编码，属于激动型G蛋白的α亚基。Gsα主要与G蛋白偶联受体偶联，通过与G蛋白的β和γ亚基解离后，将胞外信号传递至胞内，进而激活腺苷酸环化酶(adenylate cyclase，AC)产生第二信使环磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate，cAMP)最终激活下游的信号通路[3]。心肌组织中与Gsα偶联的主要是肾上腺素受体。研究表明肾上腺素受体信号转导通路的脱敏机制在心肌肥厚以及心衰的发生中起着重要的作用[4]，由此推测Gsα与心肌肥厚的发生、发展有着密切的关系。本研究拟通过主动脉弓缩窄术(transverse aortic constriction，TAC)建立压力超负荷模型小鼠，检测肥厚心肌组织中Gsα表达变化；同时拟在诱导性心肌特异性Gsα敲除模型中，观察Gsα缺失对幼鼠心肌发育的影响，以初步探讨Gsα表达与心肌发育及代偿性肥厚之间的关系。

野生型C57BL/6小鼠，Myh6-MerCreMer转基因工具鼠及Gsαfl/fl小鼠均由四川大学华西医院病理研究室提供，严格按照SPF级饲养条件进行操作。

选取8~10周体质量22~26 g的健康野生型C57BL/6雄性小鼠，用于手术建模；采用Cre/Loxp系统，将Myh6-MerCreMer小鼠与Gsαfl/fl杂交获得Myh6-MerCreMer+/-/Gsαfl/fl小鼠，将雌性Myh6-MerCreMer+/-/Gsαfl/fl与雄性Gsαfl/fl杂交，选取哺乳期的Myh6-MerCreMer+/-/Gsαfl/fl母鼠进行实验。

异氟烷购自深圳瑞沃德公司；他莫昔芬购自美国Sigma公司；HE染色试剂盒与天狼猩红染色试剂盒购自中国珠海贝索生物技术有限公司；WGA荧光抗体购自美国Life Technology公司；GNAS抗体、辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG/抗小鼠IgG均购自美国Proteintech公司，GAPDH抗体购自中国华安生物公司。

8~10周雄性C57BL/6小鼠按照随机数字表法分为两组，手术组(TAC)和假手术组(Sham)，每组各5只。使用3%异氟烷对小鼠进行深度麻醉并按压鼠尾确保反射消失。将小鼠仰卧位固定在37 ℃加热垫上，1.5%异氟烷维持小鼠的麻醉。手术区域消毒备皮，在小鼠上肢水平连线中点做一横向切口，分离皮下筋膜，在第2肋间横断胸骨，放入胸腔撑开器以扩大视野。钝性分离血管筋膜，拨开胸腺，暴露主动脉弓。使用自制引线器从主动脉弓下方穿一6.0丝线，在主动脉弓旁放置钝性的26G针头(直径0.45 mm)，结扎主动脉弓，并缓慢去除钝性针头。确认无出血后，挤压胸腔排气后关闭胸腔并缝合切口。术后，小鼠继续放于加热垫上，等待完全苏醒。Sham组小鼠的手术流程与TAC组小鼠相同，但不结扎主动脉弓。术后4周，利用超声心动图对TAC组以及Sham组的小鼠进行心功能检测(图 1)。

选取与雄性Gsαfl/fl杂交后的雌性哺乳期Myh6-MerCreMer+/-/Gsαfl/fl母鼠，按随机数表法分为对照组和实验组。实验组哺乳期母鼠予腹腔注射0.1 mL TMX(20 mg/mL，溶剂为玉米油)，而对照组母鼠予腹腔注射玉米油，连续注射10 d，从P0(Postnatal 0 day)开始(图 2)。

主动脉弓缩窄术后4周，利用超声心动图对TAC组及Sham组小鼠进行心功能检测。使用1.5%异氟烷麻醉小鼠，随之将小鼠仰卧位固定于操作台上，并使用13 MHz高频探头在胸锁乳突肌水平短轴切面采集图像，检测反映左心室舒张功能相关指标[舒张末期左心室内径(left ventricle end diastolic dimension，LVEDd)、舒张末期左心室后壁厚度(left ventricular posterior wall diameter，LVPWd)、舒张末期室间隔厚度(interventricular septal wall diameter，IVSd)等]及反映左心室收缩功能相关指标[收缩末期左心室内径(left ventricular internal diameter，LVIDs)、收缩末期左心室后壁厚度(LVPWs)、收缩末期室间隔厚度(IVSs)、左心室射血分数(left ventricle ejection fraction，LVEF)、左心室短轴缩短率(LVFS)等]。超声心动图检测后，将麻醉状态下的小鼠断颈处死，迅速打开胸腔获取心脏。将心肌组织中段泡在10%中性福尔马林固定48 h，剩余心肌组织液氮速冻后放于-80 ℃冰箱保存。

称量小鼠体质量，小鼠麻醉状态下颈椎脱臼处死后迅速获取心脏，修剪非心脏组织后拍照并称量。计算全心质量(mg)/体质量(g)。

将固定好的心肌组织进行石蜡包埋，然后进行4 μm连续切片。将脱蜡处理后的切片进行HE染色、天狼星红染色和WGA免疫荧光染色显示细胞膜(抗体浓度1∶100)，镜下观察心肌结构、心肌纤维化情况及心肌细胞的横截面积。每个样本镜下随机选择3个视野，各组选择至少3个样本，利用Image J软件定量分析心肌纤维化及心肌横截面积。

按照50~100 mg/mL的比例，将TRIzol溶液加入含心肌组织的离心管中，使用组织匀浆机匀浆2 min后，冰上静置10 min，向离心管中加入0.2倍TRIzol体积的氯仿，涡旋振荡后静置，4 ℃、12 000×g离心15 min。吸取上层液于新离心管中，再加入等体积的异丙醇，混匀静置后，4 ℃、12 000×g离心10 min。弃上清，缓慢沿离心管管壁加入1 mL 75%乙醇，震荡悬浮沉淀，再4 ℃、7 500×g离心5 min。倒去乙醇并晾干，加入RNase free water溶解RNA沉淀。提取的RNA使用HiScript RT Super Mix逆转录为cDNA。GNAS的正义链为5′-GGTCTATCCGAGTGTACCCGA-3′，反义链为5′-GGCCTTCTCACTATCTCCGTTAAA-3′；内参RPS11的正义链为5′-AGATGAAGATGCAGAGGACCA-TT-3′，反义链为5′-GACGCTTCTCAA-AGCGATTGT-3′。使用实时荧光定量PCR仪进行扩增并采集荧光信号，运用2-ΔΔCt量化Gnas mRNA的表达变化。

称取小鼠心肌组织30 mg左右，加入RIPA裂解液后使用组织匀浆机匀浆，置于冰上静置裂解1 h后，4 ℃、12 000×g离心10 min，取上清。BCA蛋白浓度测定试剂盒测定总的蛋白浓度。向剩余上清液中加入1/4上清体积的蛋白上样缓冲液，沸水浴10 min。采用SDS-PAGE配制10%凝胶，并根据蛋白浓度调整上样体积。使用恒定电压电泳后，随之使用260 mA恒定电流转膜50 min。5%脱脂奶粉在室温封闭条带2 h。使用5% BSA稀释的一抗GNAS(1∶500)，GAPDH(1∶1 000)在4 ℃孵育条带过夜。随后使用5%脱脂奶粉稀释的二抗(1∶10 000)室温孵育条带1 h。使用ECL显影液，凝胶成像系统曝光。运用Image J软件分析条带的灰度值以分析蛋白的相对表达水平。

采用GraphPad Prism 8.0统计软件分析数据，符合正态分布的计量资料以x±s表示，两组间比较采用配对t检验。P < 0.05为差异具有统计学意义。

主动脉弓缩窄术后4周，手术组仅有4只存活。对TAC组以及Sham组小鼠进行超声心动图检测，结果显示，与Sham组小鼠相比，TAC组小鼠左心室射血分数(LVEF)和左心室短轴缩短率(LVFS)稍有下降，但差异无统计学意义；TAC组小鼠舒张末期室间隔厚度(IVSd)以及舒张末期左心室后壁厚度(LVPWd)增加，但舒张末期左心室内径(LVIDd)减小，差异均具有统计学意义(P < 0.05, P < 0.01，表 1)。结果提示，主动脉缩窄术后4周，小鼠左心室收缩功能尚未降低，但舒张功能显著降低，小鼠心肌目前仍处于后负荷增加诱发的代偿性心肌肥厚状态。

与Sham组相比，TAC组小鼠心脏明显增大，小鼠心脏质量与体质量的比值增加，差异具有统计学意义(P < 0.05，图 3)。

HE染色，天狼星红染色以及麦胚凝集素(WGA)免疫荧光染色结果显示，与Sham组小鼠相比，TAC组小鼠表现为心肌肥厚及心肌纤维化，主要为血管周围纤维化，且心肌横截面积增加(图 4)。通过定量分析发现，与Sham组小鼠相比，TAC组小鼠的血管周围纤维化以及心肌横截面积显著增加(P < 0.01，图 5)。结果提示，使用26G缩窄针行主动脉弓缩窄术后4周，TAC组小鼠心脏表现为向心性的肥厚。

主动脉弓缩窄术后4周，RT-qPCR和Western blot检测两组小鼠心肌组织中Gsα的mRNA和蛋白表达量。结果提示，主动脉缩窄术4周后，与Sham组小鼠相比，TAC组小鼠心肌中Gsα的mRNA及蛋白表达水平均显著增加(P < 0.05，图 6)。

Myh6-MerCreMer小鼠和Gsαfl/fl小鼠杂交，获得诱导性心肌特异性Myh6-MerCreMer+/-/Gsαfl/fl(MCM/Gsαfl/f)小鼠。利用PCR鉴定小鼠基因型，显示MCM/Gsαfl/f小鼠构建成功。对哺乳期的MCM/Gsαfl/fl母鼠进行连续10 d TMX诱导后，分析幼鼠的体质量以及生存率发现，与玉米油诱导的幼鼠相比，TMX诱导的幼鼠表现出来明显的生长迟缓，体质量减轻，并且于P19 d开始死亡，未能存活到P22 d(图 7)。结果提示，Gsα的缺失可能影响了幼鼠心肌以及整体的发育。

Western blot检测结果显示，TMX诱导的幼鼠心肌组织中Gsα蛋白表达量比玉米油诱导的幼鼠明显降低，表明Gsα敲除效率较好。幼鼠的心肌HE染色显示，TMX诱导的幼鼠心脏大小显著小于玉米油诱导的幼鼠(图 8)。

心肌肥厚是心衰早期发生的病理生理过程。导致心肌肥厚的原因众多，其中压力负荷增加引发心肌首先发生代偿性(向心性)心肌肥厚以维持心脏功能，主要表现为心室壁增厚及心腔缩小，而持续的负荷增加，导致肥厚失代偿，表现为心腔扩张、室壁变薄、心肌收缩力下降，最终导致心力衰竭。调控心肌肥厚的分子机制复杂，研究表明肾上腺素受体信号转导通路的脱敏机制在心肌肥厚以及心衰的发生中起着重要的作用[4]。Gsα由GNAS基因编码，属于激动型G蛋白的α亚基。Gsα主要与G蛋白偶联受体偶联，通过与G蛋白的β和γ亚基解离后，将胞外信号传递至胞内，激活AC产生cAMP，最终激活下游的信号通路[3]。而心肌组织中与Gsα偶联的主要是肾上腺素受体，由此推测Gsα与心肌肥厚的发生、发展可能存在一定的关系。

本研究构建的小鼠主动脉缩窄模型，使用26G垫针，缩窄程度为中等。术后4周，与Sham组小鼠相比，TAC组小鼠的收缩功能指标LVEF和LVFS差异无统计学意义，但舒张功能指标IVSd以及LVPWd显著增加，而LVIDd显著变小，提示TAC组小鼠发生了向心性心肌肥厚，此时收缩功能处于代偿阶段。组织病理学分析提示，TAC组小鼠心肌纤维化主要聚集在血管周围，而心肌间质尚未见纤维化，与文献[5]报道一致。RT-qPCR及Western blot检测提示，TAC组小鼠心肌组织中Gsα mRNA和蛋白水平出现不同步的增加。二者的不同步可能与Gsα存在转录后调控有关[6]。上述结果提示，Gsα可能参与心肌的代偿性肥厚过程。

据以往研究报道，哺乳动物心脏正常生长发育过程中，心肌会经历由增生性生长转变为一定程度的肥厚性生长的过程[7]。那么，成功敲除Gsα基因后，是否会影响这一过程呢？基于此，我们构建了TMX诱导心肌特异性Gsα敲除幼鼠。研究结果显示，心肌特异性Gsα敲除幼鼠出现了发育迟缓，心肌肥厚性生长受到抑制，并未能存活到成年。提示Gsα在幼鼠心肌发育的肥厚性生长中亦起着重要的作用。

Gsα作为G蛋白的α亚基，广泛表达于组织中，其主要通过与β和γ亚基的结合或分离，起着分子信号转导开关的作用。已有研究表明，人类GNAS基因的突变与多种疾病相关，如奥尔布赖特遗传性骨营养不良、多发性骨纤维发育不良等[3, 8]。研究亦发现Gsα的异常表达会导致细胞的生长、增殖、凋亡及代谢出现障碍[9]，且影响平滑肌细胞的收缩和分化功能[10-11]。有关Gsα的表达变化与心血管疾病的关系研究较少，其中一项研究显示在心衰终末期的人心肌组织中，Gsα的mRNA表达水平增加，但其蛋白水平无明显变化[12]。而在本研究中，心室压力超负荷引起的心肌肥厚伴随着Gsα mRNA及蛋白表达水平增加。这一差异，是否预示着从代偿性肥厚到失代偿性肥厚转换的过程中，Gsα在转录后的翻译调控发生了变化？如果存在这种转录后调控的变化，那它是否是使心肌从代偿性肥厚发展为失代偿性肥厚的关键机制？这些问题有待后续的研究予以证实。

本研究另一个值得关注的有趣现象是出生后诱导敲除Gsα后，幼鼠出现了生长发育迟缓，心脏总体显著减小。这一结果是否系因母鼠连续进行腹腔注射他莫昔芬引起母鼠的应激以及情绪变化，从而导致其拒绝哺乳，进而影响了幼鼠的发育？对照组母鼠同样腹腔注射玉米油，而对照组幼鼠的生长发育表现为正常，这在一定程度上排除了上述注射刺激因素。因此，我们认为，Gsα的敲除可能影响了幼鼠心脏的肥厚性生长，进而同时影响了幼鼠的整体发育。这种出生后心肌特异性敲除Gsα是否引发心脏表型改变尚不清楚。但研究表明，Gsα与Hippo通路中YAP/TAZ形成闭环通路可以调控施万细胞的增殖与分化[13]，而Hippo通路与心脏的发育有着密切的关系[14]。我们大胆推测Gsα与Hippo通路相互作用可能会影响幼鼠心肌的肥厚性生长，但是相关机制亦有待后续研究加以证实。

本研究仅观察了TAC诱导出现代偿性肥厚阶段Gsα mRNA和蛋白水平变化，关于Gsα在失代偿心肌肥厚时的表达变化以及相关机制尚待后续研究。另外，出生后Gsα诱导敲除并不是直接在幼鼠体内进行，而是通过母乳传递幼鼠进行诱导敲除，因而存在一定的局限性。

总之，本研究结果显示压力超负荷早期左心室出现代偿性心肌肥厚，同时伴有Gsα mRNA和蛋白表达上调，而TMX诱导敲除乳鼠心肌Gsα后，出现生长迟缓以及出生后心肌肥厚生长受抑制。本研究为后续进一步探索心脏生长发育、心肌肥厚的分子机制和寻找心衰的早期干预靶点奠定了基础。