流式细胞术一定要设置对照组吗?对照原则了解下

在大家阅读文献的时候，应该经常能能看到下面这种图，这就是标准的——流式结果分析图，美观、简单、一目了然。

但是，很多时候，大家都做不出这种图，就算做出啦啦，结果也非常不好看，这个时候，你就要思考一下——你的实验对照设置好了吗？

有的同学说，我只是简单地检测一下细胞凋亡，就不需设置空白对照和单染对照，根据未处理组设定就行;

然而也有人说，你这样的对照设置是不可取的。

那么有关流式实验的对照设置，你的心中是否存在一些疑惑呢?

实际上，对照在任何实验中都是必不可少的，尤其在流式细胞术中，只有合理对照才可以将实验结果和背景区分，排除非特异性的效应，获得高质量的数据。

所以单一阳性对照已经很难满足其实验要求，只有对照设置的越充分，得到的实验结果才会越精准。

首先，我们需要了解非特异性信号产生的原因：

比如常见的肿瘤细胞自发荧光，会造成背景信号干扰;

又如，单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞和B细胞上，Fc受体均呈现高表达，在染色过程中抗体Fc端与细胞表面Fc受体的结合以及抗体与细胞的物理结合与粘附等，在这些细胞可能通过Fc结构域而不是抗原特异性Fab结构域与抗体发生结合，造成非特异性染色的发生;

除此外，样本中的死细胞不仅具有更强的自发荧光，而且更容易产生非特异性抗体的结合，造成假阳性。

为了避免上述情况，在流式抗体染色前需要使用Fc受体阻断剂和鉴别死细胞的活性染料对Fc受体及死细胞造成的非特异性染色加以去除。

除此之外，我们还需要根据实验具体情况设置五种对照来排除非特异性信号，下面将逐一讨论：

1. 空白对照(未染色对照)

对于细胞的自发荧光，可以设置空白对照用以区分细胞的自发荧光和特异性荧光。

2. 同型对照

在流式细胞术中，染色的背景水平是一个重要的影响因素，特别是在为罕见的低表达或者连续表达的细胞建立多色模板时，需要设置同型对照，同种型对照的作用是消除由于抗体非特异性结合到细胞表面的Fc受体及静电结合而产生的背景染色。

图：空白对照和同型对照的比较

如何选择同型对照?

一般选择相同种属来源、相同亚型和亚链、相同荧光标记但由未免疫动物血清纯化而来的抗体，比如抗鼠的CD11b BV711标记的抗体，成份是Rat IgG2b, κ。那么相应的同型对照应该是BV711标记的Rat IgG2b, κ Isotype Control。此外，需要注意的是，有些抗体的浓度和同型对照抗体的浓度不一致，使用时，应当以相同剂量为准。

在一些特殊情况下，我们可能会选择纯化的一抗+荧光标记的二抗的组合形式，这种情况下，应该选择一抗的同型对照，

比如：COX-2的纯化抗体，成分是Mouse IgG1,κ，其同型对照是纯化的Mouse IgG1,κ，荧光二抗是BV421标记的抗小鼠IgG1，染色方案如下：样本管：纯化的COX-2+BV421标记的抗Mouse IgG1(二抗)+样本;同型对照管：纯化的同型对照+BV421标记的抗Mouse IgG1(二抗)+样本。

3. 单染和补偿对照

由于荧光素发射光不是一个单一的波长，而是覆盖一定范围，

所以会有荧光渗漏到邻近波长的检测器，多色流式实验时，测量的颜色越多，越容易发生荧光渗漏，单染对照可以显示出不同荧光团之间光谱重叠的水平，并据此去除或补偿它们之间的重叠。

4. 荧光减一对照(FMO)

荧光减一对照(Fluorescence Minus One，FMO)是指实验设计里的所有荧光减去一个荧光后染色的细胞样本。

多色流式实验中，检测指标越多，越容易发生荧光溢漏，这非常影响设门的准确性，尤其是表达水平极低、需要从较大比例的阴性群体中识别阳性信号时，为了排除干扰信号，确定设门的准确性，FMO便显得尤其重要。

5. 生物学对照

生物学对照即我们所有实验都需设计的对照组，可以理解为文献中的Control或者是Vehicle组。

如细胞内染色实验涉及固定和透膜，这些步骤会影响抗原检测，自发荧光，荧光素亮度和细胞形态，生物学对照显得更为重要。

通过以上分析，我们可以发现，对照的正确应用能够使我们的实验结果更为清晰与准确。

在流式实验，尤其是多色流式中，对各种对照的充分理解与恰当应用是实验取得成功的前提，也是对实验者综合水平的一大考验。

愿大家能够从本文中有所收获，得出准确、漂亮的流式实验数据。

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