EdU检测实验操作步骤

EdU检测实验操作步骤——及荧光定量分析数据

来源/作者：普拉特泽-生物医学整体课题外包平台

一、实验目的

EdU检测不同转染处理对细胞增殖能力的影响。

二、实验样品

2.1 实验样本

备注：包括干预细胞用的相关试剂均按实验样品登记，每行登记一个或一组独立样品。

2.2 实验参数

三、实验结果

                     图1：EdU荧光检测示例图

                                              图2：荧光定量分析柱状图

四、实验结论

  如图所示，在CAL27细胞中，mimics NC和miR-23b-3p mimics组间无明显差异，与inhibitorNC组相比，miR-23b-3p inhibitor组细胞增殖能力有所上调；SCC25细胞各组间无明显差异。

请注意：因无法获知研究背景及研究方案，我司提交的结果说明仅针对该次检测结果进行客观描述，所下结论仅供参考。请合理判断该检测结果的可用性。

五、实验步骤

3.1 细胞复苏 （如有）

(1)将ddH2O预温至37℃。

(2)戴上手套和口罩帽子，从液氮罐中取出装有目的细胞的冻存管（内有1 mL细胞混合液），立即投入37℃ ddH2O中，轻摇冻存管使之在1分钟内快速溶解。

(3)完全溶解后，75%酒精擦拭冻存管外壁消毒后带进超净台。

(4)在超净台中，在15 mL灭菌离心管中预先加入10 mL新鲜配制的培养基，打开冻存管，将所有冻融的细胞悬液加入该离心管中，常温1000 rpm离心3分钟，吸除上层的培养液。

(5)1 mL培养基重悬细胞沉淀，轻轻吹打混匀后加入T25细胞培养瓶中，补足培养基至5 mL，置于37℃、5% CO2培养箱培养。

(6)48小时后换液，细胞融合接近80%时即可传代。

3.2 细胞铺板及转染 （如有）

取处于对数生长期，生长状态良好的293T细胞用0.25%胰酶消化后，通过细胞计数计算后，按照密度为4×104个细胞/孔，种到24孔板中，铺细胞18-24 h (尽量不要超过24小时，否则影响转染效率)，细胞长至70～90%转染（细胞密度过稀或者过密均会影响转染效率），以24孔板为例：

(1) 将 1.6 μL LipoFiter /2 μL Lipo2000加入50 μLopti-mem Medium中,变成预混液1，室温放置5 min。

(2) 将0.8 μg质粒/20 pmol目的片段加入到50 μL opti-mem Medium中混合，变成预混液2。

(3) 将质粒和 LipoFiter/Lipo2000混合（预混液1和预混液2进行混合），室温放置20分钟。

(4) 将24孔板里的完全培养基换成150 μL opti-mem Medium。

(5) 将转染混合液缓慢加入到24孔板，轻轻前后晃动混匀。

(6) 37℃，5% CO2培养6 h后将培养基换成完全培养基。

3.3 EdU检测实验步骤

EdU 标记：

（1）用细胞完全培养基按比例稀释EdU溶液，制备适量2×EdU 工作液，终浓度为50μM； 

（2）每孔加入37°水浴的 EdU 工作液液500μL和500μL培养基（1比1），混合均匀后于培养箱孵育6-7小时（可根据细胞增殖速度，适当调整孵育时间），使EdU终浓度为50 μM ； 

（3）弃孵育培养基，PBS（含3%BSA，以下PBS表示）清洗细胞3次，每次5分钟。 

细胞固定及通透：

（1）每孔加入1 mL细胞固定液 (即含4%多聚甲醛的 PBS)室温孵育15分钟，弃固定液；  

（2）每孔加入PBS，清洗3次，每次5分钟；

（3）每孔加入1 mL渗透剂(0.3% TritonX-100的PBS)室温孵育15分钟；PBS清洗3次，每次5分钟

EdU检测：

（1）每孔加入0.2 ml Click反应混合液，轻轻摇晃培养板以确保反应混合物可以均匀覆盖样品，体系按需配置；避光反应1-2小时；

（2）吸除Click反应液，用洗涤液洗涤3次，每次3-5分钟；  

DNA 染色：

（1） DAPI溶液的配制：按1:1000比例用PBS稀释DAPI (1000X），避光保存； 

（2） 每孔加1X DAPI溶液1ml，室温避光孵育10分钟左右；

（3）每孔加入PBS 清洗 1~3 次；

（4）采图。

五、荧光定量分析数据

注：组化定量分析采用image pro plus 6.0软件，IOD值为图片上各点光密度值的累加，此值与目标物质的总量成正比；IOD值除以目标分布区域的面积，得到平均density,此值反映了目标物质的单位面积浓度。对样品照片进行数字图像分析比较时，就是比较他们之间的平均光密度值的大小。

单位为a.u.(arbitrary unit)，是无量纲单位

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