SYBR Green I法原理/优缺点/常见问题解析

    SYBR Green I法是进行定量qpcr实验的常用方法，本文介绍了SYBR Green I法的原理、优缺点，以及进行定量qPCR的常见问题和解决方法。

一.SYBR Green I法原理

1.Sybr Green I是一种结合于小沟中的双链DNA结合染料，在PCR反应体系中，Sybr荧光染料特异性地掺入DNA双链与双链DNA结合后，发射荧光信号，而不掺入双链中的Sybr染料分子不会发射任何荧光信号。从而保证与PCR产物的增加完全同步。

2.利用荧光染料可以指示双链DNA熔点的性质，通过熔点曲线分析可以识别扩增产物和引物二聚体，因而可以区分非特异扩增，进一步地还可以实现单色多重测定。此外，由于一个PCR产物可以与多分子的染料结合，因此Sybr Green I的灵敏度很高。但是，由于Sybr Green I与所有的双链DNA相结合，因此由引物二聚体、单链二级结构以及错误的扩增产物引起的假阳性会影响定量的准确性。通过测量升高温度后荧光的变化可以帮助降低非特异性产物的影响。由解链曲线来分析产物的均一性有助于分析由Sybr Green I得到定量结果。

二.SYBR Green I法的优缺点

三.SYBR Green I法进行定量qPCR常见问题和解决方法

1.问题来源:由于SYBR Green I与双链DNA进行结合后发射荧光，因此如果反应体系中有非特异性扩增或引物二聚体的产生，也将同时被检测到，从而可能导致检测结果不准确。 2.如何检查:引入溶解曲线分析。 3.如何解决:设计合适引物，防止非特异性扩增。

四.形成引物二聚体常见原因

1.最根本的原因是引物之间或者自身存在互补序列。 2.模板量过低。 3.引物浓度过大。 4.退火时间过长。

五.如何减少引物二聚体

1.检查引物的自身结构，有无复杂的2级结构和Forword/Reverse之间的配对，尤其是3'端互作结构。 2.一般PCR体系的引物和dNTP的量是过量的，产物浓度不够可以适当增加模板量，而不是引物和dNTP。 3.Taq酶、引物，Mg2+浓度需适量，勿过高。 4.可以考虑在所配Mix中加5%的甘油或者5%的DMSO以及其它添加剂增强特异性，解除引物二聚体。 5.PCR反应体系的配制在冰上进行，最后加Taq酶，PCR结束后产物勿放置在室温下过长时间，室温下有些Taq酶可能会将多余的引物合成为二聚体。 6.如果PCR产物跑胶足够亮，可以考虑减少上样量。 7.用上次的PCR产物作模板二次PCR，提高引物与模板的特异性，减少引物。 8.直接把目的片段切胶回收，以回收得到的片段再做为模板进行PCR。

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