qPCR常见问题及分析解决方法

那什么是qPCR呢？qPCR的英文全名是Real-time Quantitative PCR Detecting System。即实时荧光定量核酸扩增检测系统，也叫实时定量基因扩增荧光检测系统，简称qPCR。

简单来说，qPCR就是利用荧光信号的变化实时监测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析。而常规的PCR是无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时监测。

qPCR的疑难杂问

Q1 如何提高RT-PCR反应的灵敏度与特异性？

Answer：

1. 首先确定模板RNA完整性好，无DNA污染。

2. RNA模板中不应含有扩增反应抑制剂。

3. 为了防止模板降解，在反应体系中加入RNase抑制剂RNasin。

4. 使用适量的模板RNA，模板量太多会降低特异性，太少会导致扩增不出条带或条带太弱。

5. 若模板中有二级结构，可通过提高逆转录反应温度来提高扩增效果。

6. 设计引物时，避免在引物3’端含有互补序列，避免形成内部发卡结构。

Q2 避免RNA降解的方法有哪些？

Answer：

1. 在用来验证完整性之前先在变性胶上分析RNA。

2. 使用良好无污染技术分离RNA。

3. 将组织从动物体取出后立刻提取RNA，并将提取好的RNA反转录为cDNA进行低温保存。

Q3 RNA中含有逆转录抑制剂时，怎么处理？

Answer：

逆转录抑制剂包括：SDS、EDTA、甘油、焦磷酸钠、亚精胺和胍盐，可将对照RNA同样品混合，同对照RNA反应比较产量以检测RNA抑制剂；若对照RNA与样品混合后产量降低，则说明样品中存在逆转录抑制剂，可用70%（v/v）乙醇对RNA沉淀进行清洗，以除去抑制剂。

Q4 如何减少RNA模板中的二级结构？

Answer：

1. 将RNA和引物在不含盐及缓冲液条件下变性、退火；提高逆转录反应温度。

2. 温度超过60℃时，不能使用oligo（dT）引物，选择一个在反应温度可以退火的GSP。

3. RT-PCR产物的长度超过1kb时，反应温度需保持在65℃。

Q5 RNA中有DNA污染的处理方式

Answer：

1. 若是基因组DNA的污染，可使用DNaseI处理RNA； 同时设置没有逆转录的对照组反应检测DNA污染。

2. 若是受到外源DNA的污染，可使用抗气雾剂和UDG酶。

Q6 qPCR探针设计的一般原则有哪些？

Answer：

1. 扩增片段的长度不应太大，一般小于300bp。

2. 探针不能和任一引物互补，且其长度在保证特异性的前提下尽可能的短，长度不要超过30bp。

3. 探针的Tm值至少比引物的Tm值高5度。

4. 探针如用于检测多态位点，多态位点应尽可能靠近探针中部。

5. 探针5’端不能是碱基G，G对荧光基团有猝灭作用。

Q7无反转录酶情况下，对照RNA仍有扩增结果

Answer：

1. 体外转录时不可能将所有DNA模板消除，因而对照组会含有痕量的DNA。建议可将第一链cDNA稀释1:10、1:100、1:1000倍以消除DNA污染造成的影响。

2. 可能是引物二聚体的条带。

Q8 扩增产物滞留在加样孔中

Answer：

1. 可能是由于模板量过高而导致PCR结果产生了高分子量的DNA胶状物。建议将第一链cDNA浓度稀释至100倍再进行二次扩增。

2. 在二次PCR时，使用的退火温度如果比引物的Tm值低5℃，可将退火温度适当增高或进行热启动以提高特异性。

Q9 无Ct信号出现

Answer：

1. 反应循环参数不够，一般要在35个循环以上，但是过多的循环次数可增加背景值。

2. 检测荧光信号的步骤有误。SYBRgreen法（SG法）采用的是72℃延伸时采集荧光信号，taqman法则是在退火结束或延伸结束时进行信号采集。

3. 引物或探针降解，可用PAGE电泳检测其完整性，若是电泳条带呈弥散状，可考虑重新合成引物或探针。

4. 模板不足或降解，则可以重新提取核酸模板。

Q10 Ct值出现过晚（Ct>38）

Answer：

1. 扩增效率低，反应条件不够优化，降低退火温度，增加镁离子浓度。

2. 反应成分降解或加样量不足。

3. PCR产物过长，一般采用80-150bp。

Q11 标准曲线线性关系不佳

Answer：

1. 加样存在误差，是样品浓度不成梯度。

2. 标准品出现降解，避免反复冻融。

3. 引物或者探针设计不佳。

4. 模板中存在抑制物或模板浓度过高。

Q12 溶解曲线存在多个主峰

Answer：

1. 引物设计不够优化。

2. 引物浓度不佳，上下游引物浓度比例不一致。

3. 镁离子浓度过高。

4. 模板基因组的污染。

Q13 同一样品中，其中某一个荧光信号特别强

Answer：

1. 试剂配制时反应液没有完全溶化，导致探针量在一管增多。

2. 试剂配制时没有充分混匀致各管中各成分的量不同。

3. PCR仪热槽被荧光物质污染，需要清除热槽中的污染。

Q14 扩增曲线有一向上或向下的尖峰？

Answer：

1. 反应过程中电压不稳定。

2. 可能在20个循环左右时，仪器有停下或仪器有开盖，使光线突然增强。

3. 如果尖峰向下，可能是由卤素灯老化所致，这时应更换。

Q15 部分样本扩增效率过低？

Answer：

1. 提取液残留，一定程度抑制了PCR反应。

2. 反应液未严格取量混匀或分装不均匀。

3. 试剂失效。

Q16 阴性对照或空白对照翘尾

Answer：

1. 模板提取环境或操作过程有污染。

2. 配液过程存在污染。

Q17 直线型扩增曲线

Answer：

1. 探针部分降解：一般稀释的探针可在4°C保存至少3个月，探针的反复冻融或导致降解；或者探针在光线下暴露时间太长了。

2. 反应液中有PCR抑制物。

Q18 没有扩增曲线

Answer：

1. PCR参数设置错误，在设计循环参数时将荧光信号读取时间设在反应的第一步，即stage1阶段。

2. 电脑设定了自动休眠。

Q19 基线下滑

Answer：

基线选取范围不对，可试着将基线范围改大一些，这一问题常因试剂质量所致。

Q20 扩增曲线断裂

Answer：

基线选取范围不对，基线终点大于Ct值，这通常是由于模板DNA浓度过高所致，因Ct值