单细胞结合肿瘤微环境异质性，构建新型肝癌预后模型，换癌种可做！

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单细胞结合肿瘤微环境异质性，构建新型肝癌预后模型，换癌种可做！

2023-03-11 10:37| 来源: 网络整理| 查看: 265

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大家好，今天给大家带来的是2022年2月发表在Cancer Cell Int.上的一篇文章。在这项研究中，作者通过整合RNA-seq和scRNA-seq，分析了肿瘤免疫微环境（TIME）在单细胞水平上的异质性，构建了一个3基因预后风险模型，可以准确评估肝细胞癌（HCC）患者的预后和对免疫治疗的反应。

Cancer Cell Int. 2022 Jan 25;22(1):38.

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期刊简介

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研究方法和流程

数据来源：

GEO数据库：下载scRNA-seq数据；

TCGA数据库、国际癌症基因组联盟（ICGC）数据库：临床数据和基因表达信息数据；

CIBERSORT进行细胞类型鉴定，评估免疫浸润细胞丰度；

加权基因共表达网络分析（WGCNA）构建基因共表达网络；

单变量 Cox 和LASSO分析来构建风险模型；

qPCR评估模型基因的表达水平。

研究成果

1.scRNA-seq数据聚类降维

作者从GEO数据库中的scRNA-seq 数据集GSE149614中提取所有基因，进行PCA降维分群和细胞类型注释；

从 cellmarker 下载了人类细胞标记基因，并使用 clusterProfiler 包富集功能定义了 25 个cluster，细胞类型由标记基因鉴定。细胞亚群信息如Table1所示；

Table 1

The information of 25 cells types

Cluster Cell type 0 CD4 + cytotoxic T cell 1 Kupffer cell 2 Liver progenitor cell 3 Endothelial cell 4 Liver bud hepatic cell 5 5 Memory T cell 6 Liver bud hepatic cell 7 Hepatocyte 8 Exhausted CD8 + T cell 9 Liver bud hepatic cell 10 Myofibroblast 11 Kupffer cell 12 Memory B cell 13 Liver bud hepatic cell 14 Liver bud hepatic cell 15 Liver bud hepatic cell 16 Cancer stem cell 17 B cell 18 Dendritic cell 19 CD4 + cytotoxic T cell 20 Kupffer cell 21 Monocyte 22 Liver progenitor cell 23 Liver bud hepatic cell 24 Dendritic cell

图1.来自肿瘤样本和正常样本的单细胞概览。

图A：四种不同类型样本的 Umap（ MLN，转移性淋巴结；MTL，转移性淋巴结；PT，原发性肿瘤；PVTT，门静脉癌栓）。

图B:来自肿瘤组织和正常对照组织的细胞的 Umap;

图C:所有细胞分为25组。

图D：细胞类型由标记基因鉴定。

相关学习：

WGCNA的基础参见：《》，我们进行了详细的讲解，WGCNA的代码我们也已经公布，参见《》。

的学习参考：

①

②

GO/KEGG的学习可以参考系列推文：

①；

②；

③。

特别注意:既往推文中代码领取方式已过期！

新的领取方法可参考：

4.风险预后模型的构建

为了筛选与肿瘤发生相关的关键基因，作者对来自TCGA数据库的基因表达数据进行差异分析。通过对上调基因、棕色模块基因和单细胞（C21）标记基因的取交集；

然后，用单变量Cox回归模型确定了TCGA-LIHC队列中与总生存率显著相关的7个基因；

LASSO-Cox回归分析用于进一步减少候选基因的数量。确定了三个基因CLTA、TALDO1和CSTB，并用于生成风险模型（图4e）；

qRT-PCR进一步评估CLTA，TALDO1和CSTB在HCC细胞系SK-Hep-1和健康活细胞系LO2中的表达。结果显示，这三个基因在HCC细胞系中均呈上调（图4f）。

图4.基于关键基因的风险模型构建。a TCGA-LIHC 队列中差异分析的火山图。b肿瘤发生相关上调基因、单核细胞（C21）标记基因和棕色模块基因的维恩图。c肿瘤发生相关下调基因、单核细胞（C21）标记基因和棕色模块基因的维恩图。d每个自变量的 LASSO 系数剖面图。e LASSO Cox 回归分析的部分似然偏差。F通过 qRT-PCR 测定的 HCC 细胞系 SK-hep-1 和正常活细胞系 LO2 中 CLTA、TALDO1 和 CSTB 的表达。

重现方法：

火山图的学习可以参考：

韦恩图的学习可以参考：

LASSO回归的学习可以参考：

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新的领取方法可参考：

5.风险预后模型的评估和验证

紧接着，作者计算TCGA-LIHC队列中每位患者的风险评分，并绘制风险评分分布，验证了模型的预后能力；

通过ICGC数据库再一次测试和验证了该模型；

结果表明：高分组的总生存时间明显短于低分组。说明作者已经构建了一个良好的预后风险模型。

图5.评估和验证预后模型的预测功效。a TCGA-LIHC 队列的风险评分分布、患者状态和 mRNA 表达热图。b TCGA-LIHC 队列的 3 基因模型的 Kaplan-Meier 曲线。c ICGC 队列的风险评分分布、患者状态和 mRNA 表达热图。d ICGC 队列的 3 基因模型的 Kaplan-Meier 曲线。缩写：TCGA-LIHC，癌症基因组图谱肝细胞癌；ICGC，国际癌症基因组联盟

6.HCC风险评分与免疫浸润细胞的关系

作者用ESTIMATE方法分析了风险评分与各种类型免疫细胞浸润水平之间的关联；

然后，通过皮尔逊相关分析计算22个免疫细胞的丰度与风险评分之间的相关性；

根据结果（详细见下图表注），作者推测该风险模型参与免疫微环境调节，并可能影响肿瘤内的抗肿瘤免疫反应。

图6.进行 ESTIMATE 以计算每位患者的免疫和基质评分。

a.高风险组和低风险组的免疫评分和基质评分的比较：高风险组的免疫评分高于低风险组，而二者的基质评分没有显著差异。

b-m.免疫细胞丰度与风险评分的相关性分析：①风险评分与免疫细胞呈负相关（图b-f）。②风险评分与免疫细胞呈正相关（图g-m）。