麦角硫因生物合成研究的新进展

麦角硫因(l-ergothioneine, EGT) 是稀有的天然手性氨基酸类强抗氧化剂，极易溶于水，是至今发现的唯一天然的2-硫代咪唑氨基酸。由于麦角硫因具有特殊的硫酮结构和较高的氧化还原电势，它在生理pH条件下不易发生自氧化，与其他硫醇类抗氧化剂(如：谷胱甘肽) 相比更加稳定[1-2]。麦角硫因具有清除自由基、解毒、维持DNA的生物合成、细胞的正常生长、细胞免疫、抗辐射、美白及抗衰老等诸多功能，尤其在抗氧化和能量调节等方面起到重要的作用，是一种多功能的细胞生理保护剂[3-4]。

人体自身不能合成麦角硫因，只能通过其转运体(ergothioneine transporter, ETT) 从饮食中摄取，且在特定的人体组织和细胞中富集[5-6]，由于ETT的存在，使麦角硫因成为可以在细胞间运输的抗氧化剂。在美国麦角硫因是属于公认安全的(generally recognized as safe, GRAS) 产品。2017年欧洲食品安全局(EFSA)通过了《关于l-麦角硫因安全性的科学意见》[7]，2018年欧盟委员会((EU) 2018/462) 批准法国四面体公司合成的L-麦角硫因可以在表 1列出的食品中使用(https://eur-lex.europa.eu/eli/reg_impl/2018/462/oj)。保健食品市场已有麦角硫因营养补充剂L-ERGOTHIONEINE、ErgoActive、ERGO+等。此外，市场上有多种含有麦角硫因的高端化妆品。

麦角硫因的制备方法包括天然生物提取法、化学合成法和生物合成法[8-9]。生物合成法具有成本低、原料易获取、产量易扩大等优点，是麦角硫因制备方法的发展方向。Han等[10]在综述中概述了麦角硫因的功能、应用、生物合成、提取和检测方法等。已发现自然界存在麦角硫因的好氧生物合成途径和厌氧生物合成途径，组氨酸、蛋氨酸和半胱氨酸是合成麦角硫因的前体[11-14]。文本重点对麦角硫因生物合成的关键酶、生物合成途径，天然可食用菌种和高产工程菌的开发等方面进行了阐述。

2010年Seebeck[15]首次发现了原核生物耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis) 中含有egtA、egtB、egtC、egtD和egtE基因的基因簇，该基因簇编码合成麦角硫因的5个酶：EgtA——γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-glutamyl cysteine synthase)、EgtB——单核非血红素铁酶(mononuclear non-heme iron enzyme)、EgtC——酰胺转移酶(amidotransferase)、EgtD——SAM (S-腺苷蛋氨酸) 依赖型组氨酸甲基转移酶(SAM-dependent histidine methyltransferase) 和EgtE——PLP结合型C–S裂解酶(PLP-mediated C–S lyase)，这些酶组成了原核生物中的麦角硫因好氧合成途径(图 1)。Jones等发现该基因簇也广泛分布在放线菌中[16]，而egtD和egtB的同源基因还存在于如蓝细菌、酸杆菌、厚壁菌和变形菌等多种原核生物中[17-18]。

在发现合成麦角硫因的基因簇后，Seebeck在体外重构了分枝杆菌麦角硫因的合成途径[15]，如图 1所示，首先半胱氨酸与谷氨酸经EgtA催化发生缩合反应，生成γ-谷氨酰半胱氨酸(γ-GC)，γ-GC作为中间产物参与麦角硫因的合成。麦角硫因合成的起始步骤是EgtD催化组氨酸和S-腺苷蛋氨酸(SAM) 合成组氨酸三甲基内盐(HER)；在Fe2+和O2存在的条件下，EgtB催化HER与γ-GC发生氧化硫化合成γ-谷氨酰-组氨酸三甲基内盐基半胱氨酸亚砜(γGC-HER)；再由EgtC催化γGC-HER脱去谷氨酸，生成组氨酸三甲基内盐基半胱氨酸亚砜(Cys-HER)；最后EgtE催化Cys-HER脱去丙酮酸和氨，生成麦角硫因。但由于耻垢分枝杆菌中的EgtE难以过量表达，Seebeck使用β-裂解酶替代EgtE重构了分枝杆菌中麦角硫因的合成过程。

近年来，EgtB、EgtC、EgtD和EgtE的结构和动力学特性、作用机制陆续被解析[20-27]。Tian等[22]研究了耐高温分枝杆菌(Mycobacterium thermoresistibile) EgtB的催化机制，EgtB在麦角硫因生物合成过程中起到两个催化作用，使硫原子发生氧化以及在γ-GC与HER之间形成C–S键。首先发生硫氧化反应，后形成C–S键，此过程同时需要Fe2+和O2的参与。EgtC催化γGC-HER脱去谷氨酸，Vit等[23]解析了耻垢分枝杆菌EgtC的结构。EgtC与底物特异性结合的活性位点残基是高度保守的序列，尽管此催化活性可能是放线菌麦角硫因生物合成所特有的，但类EgtC酶广泛分布于细菌和真菌中，暗示EgtC可能具有其他的功能[24]。EgtD催化SAM上的甲基转移至组氨酸生成HER，Misson等[25]研究了耻垢分枝杆菌EgtD与底物的结合机制，与大多数甲基转移酶不同，EgtD以甲基受体为主要底物，严格遵循一种顺序结合机制，EgtD通过抑制产物来调节麦角硫因的合成，并通过抑制甲基中间体和二甲基中间体的积累促使底物发生全甲基化。

Song等[27]对耻垢分枝杆菌中编码EgtE的基因进行了克隆表达，研究EgtE的作用机制发现它可分别以亚砜和硫醚作为底物。由图 2可见，在不添加还原剂时，EgtE催化Cys-HER合成硫代亚磺酸硫醇酯；在添加还原剂二硫苏糖醇(dithiothreitol, DTT) 时，EgtE催化Cys-HER得到的产物是麦角硫因；无论是否存在还原剂，EgtE催化组氨酸三甲基内盐基半胱氨酸硫醚得到的产物均是麦角硫因。EgtE催化Cys-HER除生成麦角硫因外，还生成丙酮酸和氨(图 1)，3种产物的摩尔比是1︰1︰1。通过测定EgtE的动力学参数发现Cys-HER是EgtE的最适底物。在生物体内，天然硫醇(如半胱氨酸、谷胱甘肽或真菌硫醇) 可以作为还原剂来发挥作用，因此，在生物体内EgtE催化Cys-HER生成的产物是麦角硫因而非硫代亚磺酸硫醇酯[27]。

Bello等[28]首次鉴定了粗糙脉孢菌(Neurospora crassa) 中的麦角硫因合成的关键基因NCU04343 (被命名为NcEgt-1)。进一步通过同源序列比对，发现霉菌、担子菌和子囊菌等能够天然合成麦角硫因的真菌均含有NcEgt-1的同源基因[29-32]，但是对于多数不能合成麦角硫因的酵母菌(如酿酒酵母、毕赤酵母、假丝酵母) 中未发现NcEgt-1的同源基因[30-31]。NcEgt-1编码的酶NcEgt-1是一个多域蛋白，N末端是SAM依赖型甲基转移酶，与鸟型分枝杆菌(Mycobacterium avium) 的EgtD有27%的同源性；C末端与鸟型分枝杆菌的EgtB有24%的同源性[28]。egtD和egtB的同源基因在多数原核生物中是相邻的基因，推测NcEgt-1可能衍生于egtD和egtB 2个基因的融合基因[28]。

在真核生物中由NcEgt-1的同源基因编码的酶被命名为Egt1，Egt1的DinB_2结构域含有铁结合基序，铁结合基序同时存在于EgtB中，这两种酶的区别之一在于底物的特异性不同。动力学研究表明，Egt1的最适底物是HER和半胱氨酸，Egt1可催化92%的半胱氨酸转化为Cys-HER，另外8%的半胱氨酸转化为半胱氨酸亚磺酸(cysteine sulfinic acid)；EgtB则仅能以HER和γ-GC作为底物[19]。由于分枝杆菌含有EgtB，在分枝杆菌中半胱氨酸首先与谷氨酸合成γ-GC，再由EgtB催化γ-GC参与到麦角硫因的生物合成途径。进一步研究Egt1的功能发现它是一种双功能酶，在麦角硫因的合成途径中参与两步反应。首先Egt1催化组氨酸转化为HER，再催化HER与半胱氨酸合成Cys-HER[19]。由于Egt1的特性，真核生物中麦角硫因的合成途径比原核中的麦角硫因合成途径更加简单。此外，γ-GC是分枝杆菌中麦角硫因和谷胱甘肽合成途径中共同的中间体，因此分枝杆菌中的麦角硫因和谷胱甘肽的合成存在竞争关系。而在真核生物中，麦角硫因和谷胱甘肽的生物合成途径中不存在共同的中间体，因此不存在竞争关系。

NcEgt-1被鉴定后，Hu等[19]挖掘了粗糙脉孢菌中egtE的同源基因NCU11365，它编码的蛋白是PLP结合型C–S裂解酶，能够催化Cys-HER转化为麦角硫因，被命名为Egt2。Irani等[33]对Egt2的作用机制进行了研究(图 3)，首先Egt2催化PLP辅因子和Cys-HER结合形成醛亚胺中间体，醛亚胺中间体的α-碳再发生去质子化生成醌类中间体；随后醌类中间体的C–S键断裂生成麦角硫因亚磺酸和PLP结合型氨基丙烯酸酯；当麦角硫因亚磺酸被释放后，底物结合位置的C156继续捕获麦角硫因亚磺酸，形成二硫键中间体；二硫键中间体可被还原剂(例如DTT) 或硫醇还原系统(例如硫氧还蛋白/硫氧还蛋白还原酶) 进一步还原，释放终产物麦角硫因，并再生C156用于下一次的循环途径(途径Ⅰ)。或者，麦角硫因亚磺酸直接从活性部位释放到溶液中，然后通过硫醇还原系统(例如，谷胱甘肽或硫氧还蛋白/硫氧还蛋白还原酶) 还原生成麦角硫因(途径Ⅱ)。

至此，粗糙脉孢菌麦角硫因的生物合成途径得到解析，其麦角硫因合成主要涉及Egt1和Egt2两个关键酶，在Fe2+和O2存在的条件下，Egt1催化HER和半胱氨酸合成Cys-HER，再由Egt2催化Cys-HER转化为麦角硫因(图 4)[33]。与分枝杆菌相比，粗糙脉孢菌中麦角硫因的合成途径更加简短，并且不需要谷氨酸和ATP的参与。

如上所述，真核生物中麦角硫因的合成主要涉及两个关键酶的参与：具有甲基转移酶与亚砜合酶活性的双功能酶和PLP依赖型C–S裂解酶。Yang等[34]发现金针菇(Flammulina velutipes) 麦角硫因的生物合成需要3个酶参与，分别是FvEgt1、FvEgt2和FvEgt3。FvEgt1与Egt1类似，同时具有甲基转移酶与组氨酸三甲基内盐基半胱氨酸亚砜合酶的活性。FvEgt2和FvEgt3则是两种作用机制不同的半胱氨酸脱硫酶，如图 5。FvEgt2被命名为半胱氨酸-半胱氨酸脱硫酶，在与半胱氨酸结合后激活S–H键，形成硫阴离子。FvEgt3是PLP依赖型半胱氨酸脱硫酶，催化PLP与Cys-HER合成酮亚胺复合物。随后，活化的硫阴离子亲核攻击酮亚胺复合物，得到麦角硫因。

随后，Yang重构了金针菇麦角硫因的生物合成途径(图 6)。首先，在Fe2+和O2存在时FvEgt1催化组氨酸、SAM和半胱氨酸合成Cys-HER，然后，在PLP的参与下，FvEgt2和FvEgt3共同催化Cys-HER发生脱硫反应生成麦角硫因。

金针菇合成麦角硫因的途径与粗糙脉孢菌合成麦角硫因途径的主要不同之处在于Cys-HER的脱硫反应：金针菇中麦角硫因的合成途径涉及两个半胱氨酸脱硫酶参与Cys-HER的脱硫反应，粗糙脉孢菌中仅有一个C–S裂解酶参与麦角硫因的合成。对金针菇麦角硫因生物合成途径的研究为天然可食用蕈菌合成麦角硫因的理论研究提供了借鉴。

上述对麦角硫因生物合成关键酶的结构、催化机制等的研究为新技术的实施奠定了基础。未来可使用人工智能和大数据分析等挖掘与设计麦角硫因合成酶的基因序列，结合基于计算技术的酶设计方法，利用三密码子饱和突变、活性位点组合突变及迭代突变等技术改造麦角硫因合成酶，提高酶的催化性能，进而提升麦角硫因的生物合成水平。

自然界还存在麦角硫因的厌氧生物合成途径。Burn等[35]发现并鉴定了一株厌氧菌——泥生绿菌(Chlorobium limicola) 中两个相邻的蛋白Clim_1148和Clim_1149，将其命名为EanA和EanB。EanA是一种甲基转移酶，其序列与耻垢分枝杆菌的EgtD序列有33%的同源性。EanB被认定是类似硫氰酸酶的硫转移酶(rhodanese-like sulfur transferase)，硫氰酸酶(rhodanese) 是催化氰化物和硫代硫酸盐反应生成硫氰酸盐和亚硫酸盐的一类酶，存在于枯草芽孢杆菌、致黑脱硫肠状菌、硫杆菌和某些光合细菌等多种细菌中。Leisinger等[36]对EanB进行了结构与作用机制的解析，发现它能够催化较高活性基团中的硫原子转移至未活化的碳原子上[37]。

EanA和EanB的发现揭示了麦角硫因的厌氧生物合成途径(图 7)。首先EanA催化组氨酸转化为HER，随后EanB在无氧的条件下直接将硫原子转移至HER的咪唑环，生成麦角硫因。Burn发现20余种厌氧细菌和古细菌中含有EanA和EanB的同源蛋白[35]。尽管厌氧生物合成途径更加简单，但已鉴定的EanA和EanB的催化速率(kcat=3.8 min–1和0.5 min–1)远低于已报道的好氧途径中EgtD和EgtB的催化速率(kcat=35 min–1和72 min–1)[35]。当下对麦角硫因生物合成的研究仍然主要集中在催化效率较高的好氧合成途径。

多种天然蕈菌能够合成麦角硫因，不仅有前述提到的金针菇[38]，还包括平菇(Pleurotus ostreatus)[39]、香菇(Lentinus edodes)[40]、紫黑灵芝(Ganoderma neo-japonicum)[41]、美味牛肝菌(Boletus edulis)[42]、双孢蘑菇(Agaricus bisporus)[43]、杏鲍菇(Pleurotus eryngii)[44]、金顶侧耳(Pleurotus citrinopileatus)[45]等。Tepwong等[40]研究了香菇菌丝体生产麦角硫因的发酵工艺，当使用25 g/L的果糖和1 g/L的天冬氨酸作为碳源时，菌丝体中麦角硫因的产量达1.89 mg/g DW，是对照组的3.15倍。向培养基中添加2 mmol/L蛋氨酸，发酵15 d菌丝体中麦角硫因的产量可达3.45 mg/g DW。Lee等[41]在研究紫黑灵芝菌丝体发酵合成麦角硫因的工艺时，发现不同种类和不同浓度的氨基酸对麦角硫因合成积累的影响具有很大差异，其中蛋氨酸对麦角硫因积累的促进作用最为明显，其次是半胱氨酸和组氨酸，向培养基中添加2 mmol/L的蛋氨酸、半胱氨酸和组氨酸，发酵10 d菌丝体中麦角硫因的含量达到1.86 mg/g DW，折算到发酵液中麦角硫因的含量为15.42 mg/L。Liang等[44]研究了10 L罐规模的杏鲍菇菌丝体发酵生产麦角硫因的工艺，装液量和接种量设定为70%和10%，在发酵第5天向培养基中添加4 mmol/L的组氨酸、1 mmol/L的半胱氨酸和1 mmol/L的蛋氨酸，发酵第18−20天菌丝体中麦角硫因的含量达到5.76−5.84 mg/g DW，折算到发酵液中麦角硫因的含量约为64.2 mg/L。Lin等[45]利用金顶侧耳菌丝体深层发酵制备麦角硫因，通过培养基优化得到麦角硫因发酵的最适碳源和最适氮源为葡萄糖和胰蛋白胨。在发酵第7天添加8 mmol/L的半胱氨酸、4 mmol/L的组氨酸和0.5 mmol/L的蛋氨酸，发酵16 d时菌丝体中麦角硫因的含量达12.99 mg/g DW，折算到发酵液中麦角硫因的含量为97.69 mg/L。汤葆莎等[46]研究了杏鲍菇深层发酵合成麦角硫因的培养基优化工艺，发现添加天冬氨酸、半胱氨酸、组氨酸、精氨酸和谷氨酸可提高麦角硫因的积累，其中组氨酸的促进效果最为显著。通过优化培养基成分得到最佳碳、氮源为玉米糁粉和蛋白胨，发酵7 d麦角硫因的产量达到20.5 mg/L。

笔者通过筛选获得高产麦角硫因的平菇菌种，研究了氨基酸、前体和外源营养因子等对麦角硫因合成积累的影响[39]，使用可以食用的培养基成分，建立了高强度积累麦角硫因的深层发酵控制策略，摇瓶发酵液中麦角硫因的积累量超过500 mg/L，完成了一株高产菌的吨级罐发酵中试。此外，由于微生物合成的麦角硫因大多积累在细胞内，只有将其移至胞外才能进行检测和利用。为适应生产安全及多个领域对产品安全的要求，笔者所在研究团队还建立了胞内麦角硫因的全水相浸提工艺[47]，使用热水代替有机溶剂作为浸提剂将胞内的麦角硫因浸提到胞外，浸提工艺优化后的浸提率达到97.1%。

利用未经基因工程改造的天然可食用蕈菌发酵制备麦角硫因，最大的优势是菌种和产品的食品安全性，如果培养基的成分都是可食用的，则麦角硫因发酵液的安全性更高。相比于基因组、转录组等组学，蕈菌代谢组学的研究相对较少，通过分析发酵过程的代谢组指导发酵过程优化，将进一步提高麦角硫因的发酵积累水平，降低生产成本。

基于麦角硫因生物合成途径与关键酶解析的理论指导，研究者们在一些模式微生物(大肠杆菌、酿酒酵母等) 内实现了麦角硫因生物合成酶的异源表达，构建了一系列的麦角硫因工程菌。Osawa等[48]将耻垢分枝杆菌基因egtA、egtB、egtC、egtD、egtE克隆至大肠杆菌(Escherichia coli)，高效表达了酶EgtA、EgtB、EgtC、EgtD和EgtE。通过添加硫代硫酸盐(半胱氨酸的硫供体) 促进了γ-GC的合成，发酵优化后麦角硫因的产量由0.2 mg/L提高到24 mg/L，提高了120倍。EgtB和EgtD是麦角硫因生物合成的关键酶[49]，Fujitani等[49]通过对麦角硫因的合成基因egtB和egtD进行过表达，并敲除调控组氨酸代谢的组氨酸氨解酶基因hutH，构建了一株生产麦角硫因的水生甲基杆菌(Methylobacterium aquaticum) 22A，发酵7 d麦角硫因的积累量达到20 mg/L，比出发菌株发酵积累麦角硫因的水平提高了12倍以上。Kamide等[50]发现了甲基杆菌(Methylobacterium sp.) 中含有一种特殊的EgtB，功能类似于真菌的Egt1，能够以半胱氨酸为底物，催化半胱氨酸与HER合成Cys-HER。Kamide将编码EgtB的基因克隆至大肠杆菌，应用该工程菌在发酵罐中分批补料培养，通过优化发酵培养基，发酵216 h麦角硫因的产量达到657 mg/L。表明EgtB及其相关调控能够影响麦角硫因的高效合成，可针对EgtB的酶活与异源表达等开展深入研究。

除关键酶的调控外，前体氨基氨酸的合成途径改造与优化也是提高麦角硫因合成效率的有效途径。王丽[51]在大肠杆菌E. coli BL21(DE3)中异源表达了两种不同来源的麦角硫因合成途径，发现在表达耻垢分枝杆菌基因簇egtBCDE的基础上，表达粟酒裂殖酵母基因egt1可提高麦角硫因的产量。通过前体氨基酸合成途径改造策略进一步提高了麦角硫因的积累，利用3 L罐进行补料分批发酵，108 h麦角硫因的积累量达到710.53 mg/L。Tanaka等[52]通过激活大肠杆菌的半胱氨酸合成与分泌系统，获得了一株高产半胱氨酸的菌株，将耻垢分枝杆菌基因egtA、egtB、egtC、egtD、egtE克隆至该菌株，并敲除了影响蛋氨酸合成的metJ基因。改造后的菌株在3 L发酵罐中进行分批补料培养，发酵过程中添加组氨酸、蛋氨酸、Na2S2O3等，发酵216 h麦角硫因的产量达到1.3 g/L，这是目前公开报道的工程菌发酵制备麦角硫因的最高发酵水平。

真菌麦角硫因的合成主要涉及两个关键酶，可大大简化合成途径的代谢调控，将来可能成为异源合成麦角硫因的主攻方向。Takusagawa等[53]在米曲霉(Aspergillus oryzae)中异源表达了粗糙脉孢菌的麦角硫因合成基因NCU04343和NCU11365，利用该工程菌固体发酵制备麦角硫因，发酵优化后麦角硫因的产量为231 mg/kg培养基，比出发菌株发酵合成麦角硫因的水平提高了20倍。Van Der Hoek等[54]将多种来源的麦角硫因合成基因克隆至酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，通过筛选发现含有NcEgt1 (粗糙脉孢菌麦角硫因合成酶1) 和CpEgt2 (麦角菌麦角硫因合成酶2) 的菌株合成麦角硫因的能力最强，并发现增加NcEgt1的拷贝数能够提高麦角硫因的产量，而增加NcEgt2的拷贝数不能促进麦角硫因的积累，表明Egt1催化的反应对麦角硫因合成代谢通量的控制起主导作用。该酿酒酵母菌株在1 L发酵罐中采用分批补料培养，发酵过程中添加组氨酸、蛋氨酸、吡哆醇等，发酵84 h麦角硫因的产量达到598 mg/L，其中59%的麦角硫因分泌到了细胞外。Yu等[55]鉴定了蕈菌灰树花(Grifola frondosa) 中合成麦角硫因的基因Gfegt1和Gfegt2，在酿酒酵母中重组表达了这2个基因，并利用该重组菌深层发酵合成麦角硫因。通过发酵工艺优化，发现与葡萄糖、果糖、麦芽糖和蔗糖相比，添加甘油更易促进麦角硫因的积累。发酵过程中每天向培养基中添加1%的甘油，麦角硫因的发酵水平提高了74.7%。

表 2汇总了天然可食用蕈菌和工程菌的麦角硫因发酵合成水平。目前对于工程菌生产麦角硫因的研究主要集中在合成酶的筛选与异源表达，对于前体物的合成与降解、麦角硫因的降解以及麦角硫因生物合成途径的调控等未展开系统的研究，可借助组学技术、代谢网络模型等系统生物学方法对麦角硫因的合成途径和调控网络进行理性设计与改造。

利用天然可食用蕈菌和食品级的原料发酵生产麦角硫因，符合食品应用的安全要求，在发酵物全组分利用方面具有优势，可以考虑与人造肉、调味品等食物结合。天然蕈菌发酵制备麦角硫因的最高发酵水平已超过500 mg/L，发酵周期通常在10−20 d。工程菌的发酵周期可控制在3−9 d，最高发酵水平已达到1.3 g/L，但是产物需经提纯后使用。

未来深入挖掘与优化合成麦角硫因的特征元件，解析菌株高产麦角硫因的遗传机制，一方面，为麦角硫因发酵过程优化提供理论指导；另一方面，借助基因编辑、多组学协同精准分析、高通量筛选等技术对底盘细胞进行改良，优化麦角硫因合成元件与底盘细胞的适配性，结合代谢网络模型调控优化麦角硫因合成途径中关键酶的合理协同表达，构建更加高效地合成麦角硫因的细胞工厂。

麦角硫因的生理作用与其理化性质，决定了它在食品、功能食品、饮料、化妆品和医药等行业具有广阔的应用前景，良好的水溶性和稳定性等独特之处，使麦角硫因在剂型的制备、保存及肠道吸收等方面更有优势。随着麦角硫因生产水平的提高及对其应用研究的深入，将促进麦角硫因在更多领域的应用开发，会涌现更多的麦角硫因产品，满足多方面高端市场需求。