【菌周刊】菌种建库篇｜大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备

大肠杆菌是人和许多动物肠道中最主要且数量最多的一种细菌，具有由肽聚糖组成的细胞壁，仅有拟核，细胞质中的质粒常用作基因工程中的运载体。因其拥有全基因组测序的优势，基因克隆表达系统成熟完善，被美国FDA批准为安全的基因工程受体生物。

在大肠杆菌中有许多感受态细胞，是受体细胞经过特殊方法处理后，细胞膜的通透性发生改变，从而允许外源DNA的载体分子通过的细胞。接下来我们了解一些关于大肠杆菌DH5α感受态细胞的原理和制备过程。

感受态细胞

在大肠杆菌感受态制备和转化过程中，Ca2+使得细菌细胞膜发生了一系列变化，从而极大增加了外源质粒进入细胞内部的机率。处于这样一种状态的细菌细胞，就称之为“感受态”细胞。

感受态细胞的制备和转化是分子生物学实验中频繁使用的重要操作，最早的大肠杆菌感受态细胞制备的方法是Cohen等人于1972年建立的，该方法的主要原理是细菌通过冰冷的CaCl2低渗溶液处理后，加入待转化质粒DNA，经42 ℃短时间热冲击，细菌细胞可增加对该质粒DNA的摄入，该法已成为目前实验室制备感受态细胞的常规实验方法。

DH5α菌株

DH5α常用于质粒克隆。E. coli DH5α在使用pUC系列质粒载体转化时，可与载体编码的β-半乳糖苷酶氨基端实现α-互补，可用于蓝白斑筛选鉴别重组菌株。recA1和endA1的突变有利于克隆DNA的稳定和高纯度质粒DNA的提取，因此，作为工程菌常用于分子克隆、质粒提取。

星耀小TIP：

1、因为有些载体都带有一个LacZ基因的调控序列和头146个氨基酸的编码信息，编码α-互补肽，该肽段能与宿主编码的缺陷型β-半乳糖苷酶实现基因内互补（α-互补）。当这种载体转入可编码β-半乳糖苷酶C端部分序列的宿主细胞中时，在异丙基-β-D硫代半乳糖苷(IPTG）的诱导下，宿主可同时合成这两种肽段，虽然它们各自都没有酶活性，但它们可以融为一体形成具有酶活性的蛋白质。所以称这种现象为a-互补现象。

2、由互补产生的β-半乳糖苷酶（LacZ）能够作用于生色底物5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷（X-gal）而产生蓝色的菌落，所以利用这个特点，在载体的该基因编码序列之间人工放入个多克隆位点，当插入一个外源DNA片段时，会造成LacZ（α）基因的失活，破坏α-互补作用，就不能产生具有活性的酶。所以，有重组质粒的菌落为白色，而没有重组质粒的菌落为蓝色。

对细菌而言，为达到高效转化，活细胞数务必少于108细胞/mL。对于大多数E.coli来说，相当于OD600为0.4左右，但由于转化是一个很复杂的过程，具体的作用机理仍在探究中。有文献指出，细菌的最佳感受态细胞制备期对于不同菌株是不同的，并不一定都是在活细胞浓度为 108 细胞/mL的时候最适宜，故针对所使用的菌株确定其最佳转化条件仍有必要。

DH5α菌株是一种经诱变的菌株，其基本特性是：Rˉ、Mˉ、AMPˉ。Mˉ指DH5α菌株缺乏DNA修饰，即其自身DNA不会被修饰。Rˉ指其缺乏“免疫”机制，不会对导入的外源DNA切割。AMPˉ指其对氨苄青霉素敏感。DH5α菌株可以用于制作基因库等，除此之外，因其特性，可用作基因工程的受体菌，在用作工程菌时常被用于质粒克隆和原核表达研究。

大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备过程

CaCl2法是目前使用较多的大肠杆菌制备方法。通过CaCl2处理受体菌，就可以使大肠杆菌细胞具备接受外援DNA的能力。在CaCl2处理和制备大肠杆菌感受态细胞的过程中，Ca2+是感受态建立和转化的必要条件。Ca2+的作用，就是与细菌细胞膜上的多聚无机磷酸和多聚羟基丁酸化合物形成抗DNA酶(DNase)的羟基-磷酸钙复合物，并黏附在细菌细胞膜的外表面上，破坏细菌细胞膜上的脂质阵列，从而方便外源DNA的渗入。CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞，操作简便，同时转化率也比较高，可以达到5×10～2×10转化子/微克质粒DNA。如何使用CaCl2法来制备感受态细胞呢？接下来我们浅谈一下DH5α菌株的制备方法。

制备方法：

制备方法参照《Molecular Cloning》所介绍的CaCl2法。

1、从37 ℃培养过夜的新鲜平板中挑DH5α单菌落，接种到 5 mL LB培养基中，37 ℃下270 r /min震荡培养过夜；

2、取2 mL过夜培养菌液注入到 100 mL LB培养基中，37℃下激烈震荡培养至A600=0.4～0.6（约2h）；

3、将培养液转移到灭菌过的50 mL离心管中,在冰上放置 10 min; 4℃下4000 r/min离心10 min，弃上清回收菌体;

4、倒置离心管并用无菌滤纸尽可能吸干上清培养液，用50mL预冷的无菌0.1 mol/L CaCl2溶液重新悬浮每份细菌沉淀，冰浴30～60 min；

5、再次于4 ℃下4000 r/min离心10 min，弃上清并用无菌滤纸尽可能吸干上清液;

6、用10 mL预冷的无菌0.1 mol/L CaCl2溶液再次悬浮每份细菌沉淀，每份100 uL分装。

星耀小TIP：

1、   作为基因工程和分子生物学研究中常用的技术，大肠杆菌感受态细胞的转化方法目前主要有氯化钙法、醋酸锂法、电激法等多种手段，而氯化钙法由于操作简单，成本较低，因此在常规实验中应用最为广泛。

2、   CaCl2法所制备的大肠杆菌感受态细胞，往往对于温度和保存时间有较高的要求，转化率也受到诸多因素影响。因此，在实际实验中需要对新鲜处理的感受态细胞进行复杂的甘油、液氮处理及超低温保存，过多的样品处理环节就需要购置昂贵的超低温设备，增加实验成本，延迟操作时间，也会增加转化污染的可能。

3、   大多数分子生物学和基因工程常规实验，例如DNA测序、载体构建等，往往对于感受态细胞的转化率要求并不是非常高。每个平板中有一百个以上的成功转化子，足以支持实验需求。但这些繁琐的重复性实验，则对实验的简便性要求较高。

DH5α在生物工程中的具体应用

质粒pGEM在DH5α感受态细胞内的转化研究

绿色荧光蛋白（Green Fluorescent Protein，GFP）是源于海洋生物多管水母属(aequoia victoria)的一种发光蛋白，由约238个氨基酸组成，能够自身催化形成生色团并在蓝光激发下发出绿色荧光，可在活细胞内稳定表达。在细胞生物学与分子生物学中，绿色荧光蛋白（GFP）能在不同的细胞内稳定表达，无种属、组织和位置特异性，对细胞无毒性且检测方法简单，故常用做报告基因（reporter gene）。通过基因工程技术，绿色荧光蛋白（GFP）基因能转进不同物种的基因组，在后代中持续表达。目前绿色荧光蛋白（GFP）基因已被导入并表达在许多物种，包括细菌、酵母和其他真菌的细胞。

我们从含GFP的大肠杆菌中提取质粒，利用胶回收试剂盒纯化质粒后，采用CaCl2法将工程菌DH5α制成感受态细胞，然后将纯化后的质粒转入已制备好的感受态细胞中，使得工程菌DH5α转化成具有抗氨苄青霉素的大肠杆菌，并表达绿色荧光蛋白，接种于加氨苄青霉素的LB培养基上，来筛选阳性克隆。

质粒pGEM是一长度为4.7 kb的环形DNA，在其序列中有一编码绿色荧光蛋白的基因，结构中有来自大肠杆菌T7及T3噬菌体的强启动子下游装置多克隆位点，组建成质粒载体(pGEM)就有可能合成高比活度的单链DNA探针。

在此篇文章中，我们主要讲述实验室中质粒pGEM在DH5α感受态细胞内的转化研究方法。

实验流程：

1、 GFP质粒 DNA的大剂量制备

往1L烧瓶中加入500 ml含有适当抗生素（氨苄青霉素）的LB培养基，然后加入5 ml过夜培养的带有所需质粒的大肠杆菌( GFP)培养物，再于37℃摇床培养至饱和状态；

于4℃环境中，6000 g 离心10 min ,倒掉上清液；

用4 ml GTE溶液重悬沉淀并转移到一个容积为50ml的高速离心管中；

加入 1 ml新配制的含20 mg/ml溶菌酶的GTE 溶液重悬沉淀，于室温放置10min。

加入 10 ml新配的 NaOH/SDS 溶液，并轻轻混匀直至液体变得均一、清亮而且粘稠，并于冰上放置10 min；

加入7.5 g 乙酸钾溶液，用吸管轻轻搅拌直至粘稠度下降并形成大的沉淀，于冰上放置10min，于4 ℃ 20000 g 离心10 min，将上清液轻轻倒入至另一干净的离心管中；

加入0.6倍体积的异丙醇颠倒混匀，室温放置5～10 min。于室温1500 g离心10 min；

加入2 ml 70%乙醇轻轻洗涤沉淀,然后12000 r/min离心 5 min，吸去乙醇，并真空干燥，最后凝胶电泳检测结果。

2、 快速胶回收质粒DNA

上样电泳，切下目的条带，胶块尽量小；

按100 µl胶块加700µl溶胶液的比例，室温溶胶(或55℃溶胶)，其间偶尔摇动，装柱，9000 r/min离心30 s，去掉废液；

500µl漂洗液漂洗，12000 r/min离心30 s；

重复漂洗1次；

倒掉废液后﹐再于12000 r/min离心2 min；

在柱子中加入合适体积的洗脱缓冲液(通常30～50 µl)12000 r/min离心洗脱。

3、 质粒pGEM 的转化

用冷却的无菌吸头从每种感受态细胞悬液中各取200 µl转移到无菌的微量离心管中，每管加质粒pGEM（体积≤10 µl，DNA≤50 mg），轻轻旋动以混匀内容物，在冰中放置30 min；

将管放到预加温到42℃水浴中90 s，不要摇动试管。快速将管转移到冰浴中，使细胞冷却1～2 min；

每管加800 µl LB培养基，水浴加温到37℃，然后37 ℃摇床60 r/min（温和摇动），温育45 min使细胞复苏；

将适当体积已转化的感受态细胞接种于含50 µg/ml氨苄青霉素的LB 上。在3个加抗生素的平板上分别加入100、200 、300 µl并涂平,在加抗生素的平板上接种DH5α，然后再在无抗生素的平板上加100 µl感受态细胞液，作为空白对照；

将平板置于室温直至液体被吸收；

倒置平板于37℃培养12~16 h。

总结

在提取并纯化了质粒pGEM的基础上，通过实验图解可以看出，采用氯化钙法制备的感受态细胞活性良好，通过转化自制的质粒，获得了大量阳性克隆，转化后的菌体有了抗抗生素功能而且绿色荧光蛋白表达正常。

耀海生物

 由上述实验可知，DH5α不仅是实验室中常用的菌株，还广泛应用于工艺生产中。耀海生物目前科研级mRNA平台的预制品——增强型绿色荧光蛋白（eGFP）已问世。增强型绿色荧光蛋白（eGFP）是 GFP的突变体，发射出的荧光强度比GFP大6倍以上，是一种比GFP更适合用来研究基因表达、调控、细胞分化及蛋白质在生物体内定位和转运等基因工程的报告基因。耀海生物搭建科研级mRNA平台提供预制品：在创新药蓬勃发展的大环境下，耀海生物搭建了“RNASci”mRNA科研级样品制备服务平台。基于酶法加帽和共转录加帽，耀海生物现已推出自主开发设计的科研级预制品mRNA-eGFP（增强绿色荧光蛋白）。

此外，耀海生物还提供定制化服务：

作为科研用mRNA定制合成行业的新星，耀海生物亦提供序列设计、转录模板制备、体外转录、mRNA纯化的一站式服务，制备工艺稳定，长度最高达9kb，耗时短，最快7个工作日内交付。

耀海生物mRNA相关产品稳定的物流运输：

在mRNA产品包装的运输上耀海生物也坚持使用全程冷链运输，交付稳定迅速。同时配有专属客服VIP服务，享受物流信息查询，部分城市可享受销售人员送货上门等系列服务。

大肠杆菌是实验室常用的菌种，人们对其细胞形态及生理生化特性已经了解得比较深入，对于培养基配制与运载体导入的具体技术等方面也更容易把握。耀海生物在原核生物上选择大肠杆菌为表达体系，DH5α更是耀海工艺生产中常用的感受态细胞。耀海生物拥有制定最适合菌种以及表达物的质量标准，确保质量标准的有效性及权威性的能力，且重视客户意见，会根据客户的需求以及条件，建立并交付整套质量标准以及检测方法。

参考文献：

[1]H olsters M ,W aele D , Dep 1 A , et al . T ransfection and tran sfo r-m ation of A gro bacterium t um efaciens [ J ]. Mo l Gen Gent ,1978，183:181~187.

[2] N ishiguchi R，T ak a nami M , oka A . Characte riz ation and se-quence det erm ination of the replicator regio n in t he hairy " root”inducting plasmid PR IA 4b [ J]. Mo l Gen Gent , 1987,206 :128.

[3] R a le igh EA. O rgan iza tion and function of the m cBCgenes ofEsche rich ia coli K-12[ J]. M ol M ic rob iol 19926 ( 9 ):1079 —1086.

[4] M andelM , H ga A. Ca le itam -dependen t bac te riophage DNA in bec-tion[ J]. JMol B iol 1970,53( 1):159—162.

[5] lnoue H, N ojin a H,Okayam a H. H igh effic iency tmansfo m ation ofEscherich ia coli w ith plasm idls[ J]. G ene 1990,96(1):23—28.

[6] Taketo A. DNA transfection of Escherich ia co li by e kc tropora tion[ J].B ioch im B iophys Acla, 1988,949( 3):318—324.

耀海生物，作为中国生物医药产业蓬勃发展的亲历者和见证者，深耕微生物表达体系CDMO服务多年，业务聚焦在“重组蛋白/多肽、质粒/mRNA、纳米抗体、新型重组疫苗”等领域，致力于打造CRO/CDMO/MAH开放式、全方位、一体化的产研服务平台。

用心服务，共创未来。十年来，耀海生物坚持创新发展，坚定不移走在不断提高和完善研发、生产、质量管理与控制服务体系的道路上，以平台技术构筑实力底蕴，并以全面的服务能力、丰富的项目经验及规模领先优势，为国内外制药公司提供从工艺开发到商业化生产的全生命周期CDMO服务，助推客户新药项目顺利推进，为中国生物医药产业发展持续赋能。