解析基因疗法：四种治疗策略

“基因疗法对于遗传类疾病，基因功能异常疾病中，是一种突破性疗法。大体归纳相关疗法的四种策略：基因替换，基因沉默，基因加成，基因编辑是基因治疗常用的四个策略”

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基因置换

这种策略的目的是提供一种基因产品，以弥补功能缺失的突变。基因置换适用于治疗隐性单基因疾病，并在临床上取得了最大的成功，比如：Glybera（Amsterdam Molecular 制药公司研发，后UniQure公司收购收购，治疗脂蛋白脂肪酶缺乏症（LPLD））和Luxturna（基因疗法先锋Spark的重磅产品，治疗莱伯氏先天性黑蒙症）。Glybera是一个基于rAVV1的平台，它提供一种编码脂蛋白脂肪酶(LPL)基因的超活性形式来治疗LPL缺乏。使用高活性变异体的好处是，减少载体剂量。正如下文所述，这不仅减轻了制造负担，而且降低了衣壳免疫力。Luxturna是一个基于AAV2的平台，提供RPE65基因盒来治疗由RPE65双等位基因突变引起的视网膜营养不良。Glybera和Luxturna分别在肌肉和眼睛局部使用。从AAV1和AAV2衍生的AAV载体仍在一些临床研究中进行，目的是将基因局部传递到肌肉、眼睛或大脑。然而，两种衣壳在全身注射后获得广泛基因传递的能力有限。

在21世纪初，发现了一个新的自然发生的灵长类AAV血清型和变种家族，极大地扩展了衣壳的工具箱，以实现在血管内注射之后更广泛的转基因传递。一些正在进行的基因替代临床试验利用这些较新的衣壳，并显示了有希望的治疗结果，包括血友病a和血友病b(靶向肝脏)、DMD(针对全身肌肉)和SMA(针对广泛的中枢神经系统，包括脊髓)的试验。在许多情况下，恢复正常生理水平的蛋白质生产可以减轻疾病。在许多疾病中，将功能性转基因传递给受影响组织中的一部分细胞就足够了。

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基因沉默

相对于基因替换，基因沉默主要针对由毒性增益突变引起的单基因疾病，如亨廷顿病.由于其抑制基因表达的能力，RNAi策略目前主导着基于rAAV的基因沉默平台。然而，与快速发展的合成RNAi疗法相比，基于rAAV的RNAi治疗仍处于临床前开发阶段。基因沉默往往需要组织显性率，才能获得有意义的治疗效果，这对具有特定靶器官(如人脑)的AAV载体来说是一个挑战。此外，高水平的PolIII驱动的shRNAs可能压倒内源性miRNA的生物发生途径，从而导致毒素。RNAi的脱靶沉默是另一个安全问题。虽然将shRNAs嵌入到一个由PolII启动子转录的amiR支架中，可以显著减少离目标沉默，并产生可耐受数量的小干扰RNA(SiRNA)分子，但RNAi的有效性可能会降低。无论shRNA是如何构建和表达的，编码shRNA的短发夹状DNA结构在载体产生过程中会导致rAAV基因组的截短，并可能破坏载体基因组的同源性。有趣的是，表达siRNA的工程引物PrimiR-33不仅可以提高rAAV基因组的完整性，而且还可以降低与内源性RNAi的脱靶沉默和/或饱和相关的毒性。重要的是，来自pri-miR-33支架的amiR具有与polⅢ驱动的shRNAs相当的RNAi功能。

除了RNAi之外，最近报道的Cas13蛋白家族还提供了另一种方法，在mRNA水平沉默基因的表达。这些蛋白质具有强大的RNA引导的核糖核酸酶活性，似乎比RNAi更特异。在转录水平上，由双AAV载体传递的CRISPR-Cas9抑制剂可以沉默基因表达。然而，CRISPR-Cas9的翻译使用将面临几个障碍，包括rAAV包装尺寸的限制和对来自Cas9来源于致病性化脓性金葡菌，有很强的免疫原性。

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基因加成

除了单基因疾病外，rAAV 介导的基因治疗另外一个策略，通过基因加成治疗复杂遗传病和获得性疾病。人类疾病，如心力衰竭和传染病，代表了一些最紧迫的未得到满足的医疗需求。基因添加可以多种方式调节这些疾病，例如为神经疾病提供神经营养因子，调节心力衰竭的信号通路和癌症。一种值得注意的基因加成策略采用rAAV传递编码重组抗体的基因，这些基因可以中和致命的病毒感染。这些平台利用肌肉内传递，将被转导的肌肉细胞转化为生物工厂，产生分泌到血液中的治疗性抗体。目前正在对这一战略进行临床艾滋病毒感染测试。一个挑战是增强对载体抗体的免疫力，因为它们可以被认为是外来蛋白。这种抗体反应可以抑制循环抗体浓度低于靶向阈值，限制疗效.下文将进一步讨论rAAV相关的免疫反应。

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基因编辑

快速发展的基因编辑技术为直接修复人类疾病的突变提供了一个通用的工具箱。治疗性基因编辑通常有两个步骤：在基因组中产生目标DNA断裂和DNA修复，最终导致所需的DNA改变。已开发出一系列可编辑核酸酶来产生DNA断裂，如工程上的中核酶、锌指核酸酶（ZFN）、转录激活因子样效应核酸酶和CRISPR相关蛋白。ZFN耐受性好，因为它们是从人类蛋白质中衍生出来的，而且它们的小转基因大小可以被rAAV封装。相对于ZFNs，Cas蛋白来源于细菌，其免疫原性是rAAV基因传递的潜在障碍。此外，它们较大的cDNA大小使rAAV的传递变得不那么灵活。然而，Cas蛋白是一种强大的基因编辑系统，它可以很容易地编程来针对特定的基因组DNA位点，并且仍然是研究和治疗应用中研究最广泛的可编程核酸酶。导致治疗性基因编辑结果的主要细胞DNA修复途径包括非同源末端连接(NHEJ)和HDR，它们通常被用来引入基因破坏和精确校正。除了传递核酸酶转基因外，单链rAAV基因组还可以作为供体模板来实现HDR。序列特异性核酸酶和DNA修复机制的协同作用可以产生许多治疗性的基因编辑方法，而不仅仅是通过NHEJ破坏一个基因，并通过HDR直接修复一个突变。例如，第一个在体内的rAAV基因编辑临床试验正在进行中。该策略利用ZFN平台和HDR途径，将治疗基因准确地插入白蛋白位点，增强白蛋白启动子，驱动肝细胞的转基因表达。其他值得注意的治疗基因编辑方法包括：外显子缺失，在不破坏开放阅读框的情况下删除突变；剪接调制，以重组蛋白质编码序列；等位基因交换，修复隐性复合杂合子突变。

值得注意的是，基础编辑已经成为一种强有力的治疗基因编辑方法，它直接将一个碱基对转化为另一个碱基对，而不产生双链DNA断裂。DNA碱基编辑器包括用于序列识别的RNA引导、催化非活性形式的Cas和实现碱基转化的融合效应物。DNA碱基编辑器设计的改进现在极大地提高了编辑效率、准确性和灵活性。

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