突破

问题

迄今为止，已鉴定出超过 5,000 种人类疾病基因。然而，通过对患者进行诊断测序，在这些基因中发现的超过 40% 的基因序列变异无法确定是疾病的病因。已鉴定出数以百万计的此类变异，称为不确定意义变异 (VUS)，其中大部分是细微的遗传变化，仅导致编码蛋白质发生微小变化，例如氨基酸替换，其功能影响 很少被预测。VUS 导致大量患者未被诊断，排除了预后、咨询和适当治疗的可能性。因此，需要制定一种策略来研究特定 VUS 在疾病中的作用以及它是否影响对药物的反应。一种可能的方法是使用在实验环境中测试VUS 的功能，因此，临床遗传学界对功能测定的需求很高。然而，技术障碍阻碍了对大多数疾病进行功能检测的开发。值得注意的是，疾病表型的多样性需要相应大量的测量指标，与此同时，化验需要准确可靠，同时也需要快速且经济实惠，以适应更广泛的应用。

解决方案

最近有科学家开发了 CRISPR-Select——一种多功能的功能性检测方法，用于确定遗传变异的后果（图 1）。

图1 CRISPR-Select：遗传变异的多参数和准确功能分析

该方法使用 CRISPR–Cas9敲入技术在疾病相关细胞群中来设计包含特定遗传变异或同义（沉默）突变 (WT') 。然后跟踪变异细胞相对于 WT' 细胞的绝对频率随时间的变化，以确定变异对细胞增殖或存活的影响；空间，以确定对细胞运动性或侵袭性的不同影响；和 FACS 标记水平，以确定对给定生理或病理细胞过程的变异影响。变异和 WT' 细胞的绝对频率由基因组 PCR 和随后的靶位点的二代测序 (NGS) 确定。这种方法提供了一种准确、高性价比且快速（短至 1-3 周）的检测方法。

在癌症变异上测试了 CRISPR-Select，揭示了具有肿瘤抑制或致癌功能的变异，并验证了致癌基因作为候选药物靶点。该方法被证明可用于将 VUS 重新分类为良性或致病，提供从小到大的变异效应的定量测量。当试图了解基因型-药物相互作用时，该方法被证明可有效确定变异是否赋予药物反应性或耐药性，以及药物是否通过预期靶点发挥作用。此外，该方法能够对疾病中的变异作用进行机械剖析。例如，我们发现变异赋予细胞癌症标志，如持续增殖、抗凋亡或侵袭性，或引发特定的促癌生化过程，如 DNA 损伤。该方法适用于任何测试的人类细胞类型（原代类器官、永生化细胞系或癌细胞系）。

影响

设想 CRISPR-Select 可用于临床的变异分析，以帮助建立分子诊断、预后和对遗传病个性化药物的反应。它还可能有助于系统地将数据库中存在的数百万 VUS 重新分类为良性或致病性。该方法是解决基本生物学问题、生物技术药物开发和测试的强大研究工具，可能适用于任何生物体的细胞。

CRISPR-Select 的一个限制是它无法同时设计和分析同一细胞中不同基因的多个变异，这种方法否则可用于多基因疾病的建模。

斯坦福大学的Lei Stanley Qi教授点评

该论文报告了一种称为 CRISPR-Select 的智能策略，用于评估突变的功能。该方法非常有趣且易于实施，可以允许许多研究人员评估他们感兴趣的突变。通过部署经过编辑的细胞混合物并量化包含两个突变的等位基因的相对丰度，研究人员应该能够使用 CRISPR-Select 更好地评估所需突变的功能。

基因游侠点评

VUS是临床上非常头疼的问题，而功能验证有助于进一步划分VUS，但很多基因没有现成的功能验证方法或即使有也很贵，近年来出现了一种变异效应的多重分析 (MAVEs)技术可以对目标基因所有的错义突变进行功能评估，但该技术也只能对少数的基因有价值，本文提到的CRISPR-Select技术是对MAVEs技术的进一步升级，主要是检测的维度更多，适用的目标基因更多，建议国内的企业多关注并跟进这一技术，第一作者看名字是中国人，要是有企业把他挖回国内就太好了。

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