基于PARMS技术的结核分枝杆菌利福平耐药基因rpoB分子标记的开发

结核病是一种古老的严重慢性消耗性传染病，由结核分枝杆菌Mycobacterium tuberculosis (MTB) 复合群引起，一直以来高居传染病死因之首。世界卫生组织(World Health Organization，WHO) 2019年全球结核病报告显示，2018年全球新发结核病患者约1 000万例，死亡124万例；全球估算利福平耐药结核病患者约为48.4万例，其中78%为耐多药结核病人；有23万例利福平耐药以及耐多药结核病病人致死，耐药导致的结核病死亡比例远大于普通结核病的平均死亡比例[1]。全球结核病防治工作任重道远，已成为困扰公共卫生的最大问题。利福平(Rifampicin，RFP) 耐药MTB受到格外重视，结核病患者对其耐药绝大多数(约95%–98%) 同RFP作用的靶分子RNA聚合酶β亚基的编码基因rpoB突变有关，且这些突变均集中在81 bp的利福平耐药决定区(Rifampicin resistance determining region，RRDR)，对应编码氨基酸507–533[2]。几乎所有RFP耐药菌株也对其他药物，特别是另一种一线药物异烟肼(INH) 具有抗性，因此普遍将RFP耐药视为耐多药菌株的标志性特征[3]。

目前耐药性检测的“金标准”是表型药物敏感性检测，通过观察对比MTB在含药和不含药培养基中的生长情况来判断其耐药性，但最少需耗时2–4周，不能及时获知检测结果[4]。Xpert MTB/RIF和MTB DRplus是WHO批准的两种标准分子诊断方法。Xpert以多重荧光定量PCR为基础，设计引物探针选择性覆盖RRDR，能同时检测MTB和RFP耐药基因rpoB是否存在突变，判断MTB耐药性[5]。样本RRDR序列上某个位点存在突变，就会引起探针结合失败，仪器判定结果为利福平耐药，但无法检出具体突变位点及性质。DRplus应用核酸线性探针杂交技术，采用8个野生型(Wild type，WT) 探针和4种特异性突变型(Mutant type，MUT) 探针检测RFP和INH的部分耐药基因来判断MTB耐药性[6]。优于Xpert只覆盖区域的检测，DRplus可以根据MUT探针染色阳性判断4个RFP耐药最普遍的特异性点突变(S531L、H526Y、H526D和D516V)。但除这4种突变类型外，DRplus同Xpert一样，只能根据WT探针的缺失报告存在其他突变，无法鉴定rpoB基因的具体突变性质，对于不影响耐药表型的同义突变存在报告假阳性的情况[7-8]。基因芯片技术固定寡核苷酸探针与荧光物质标记的DNA杂交，将多个位点集成到一张芯片上通过信号强度判断样本信息。但过程烦琐，PCR扩增后杂交、洗涤干燥、扫描，对实验仪器及人员要求较高[9-10]。

新型的五引物扩增受阻突变体系PARMS (Penta-primer amplification refractory mutation system) 是一种结合突变扩增系统ARMS (Amplification refractory mutation system) 的基因分型技术，在ARMS-PCR基础上增加了两条由6-羧基荧光素(6-carboxy-fluorescein，FAM) 和六氯-6-甲基荧光素(Hexachloroflurescein，HEX) 标记的引物，通过不同的荧光信号来检测基因的多态性。卿冬进等利用该技术成功实现了抗稻瘟病基因Pigm序列与其等位基因的区分，并开发了水稻粒宽调控基因GW8的荧光分子标记[11-12]。律文堂等利用该技术对水稻CRISPR/Cas9基因编辑植株进行了基因分型，鉴定结果与聚丙烯酰胺凝胶电泳(Polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE)检测和Sanger测序法一致[13]。PARMS技术在不降低综合检测准确性的前提下，变特异性荧光标记探针为通用荧光标记探针，大幅降低了探针合成与标记成本，十分适合高通量基因分型检测。且目前尚未见其在多位点联合检测及耐药基因检测上的应用。

因此，本文期望将PARMS技术应用于RFP相关基因突变的检测中，为MTB分子耐药性检测提供新思路。本文通过MTB-RFP耐药菌株rpoB突变基因与其等位基因的对比，结合PARMS技术开发rpoB基因的荧光分子标记，分析待检位点基因分型结果，以准确判断RFP耐药性。

供试结核菌株来源于河南科技大学第一附属医院提供的104例抗酸染色为阳性的肺结核患者痰标本，所有菌株经改良罗氏培养基培养，用含对硝基苯甲酸和噻吩-2-羧酸肼培养基初步菌型鉴定为结核分枝杆菌。菌株培养和DNA提取实验在河南科技大学第一附属医院检验科的BSL-2生物安全实验室进行操作。标准株H37Rv (ATCC27294) 由中国疾病预防控制中心传染病预防控制研究所结核病实验室提供。

用灭菌的接种环刮取培养基上一满环的菌落放于磨菌瓶底部，加入灭菌5% Tween 80水溶液，充分振荡研磨后制成菌液，与标准麦氏瓶比浊，滴加生理盐水比浊制为1 mg/mL的菌悬液，再稀释至10–2 mg/mL和10–4 mg/mL。使用22SWG标准环分别蘸取，划线法均匀接种到含利福平(40 μg/mL) 的罗氏固体培养基和空白对照培养基，37 ℃培养4周后读菌落数，计算耐药百分比，含药培养基菌落数/对照不含药培养基菌落数≤1%即为敏感，＞1%为耐药。

用于显色药敏最小抑菌浓度(MIC) 检测的利福平含药培养基药物终浓度分别为0.5、1、5、20、30、40、50、60、80 μg/mL。

细菌DNA提取试剂盒购于生工生物工程(上海) 股份有限公司，按照说明书进行样本DNA提取，得到上清液保存备用。

从GenBank获得rpoB序列(登录号：KY702773.1)，选用上游引物5′-CGACCACTTC GGCAACCG-3′，下游引物5′-TCGATCGGGCAC ATCCGG-3′进行PCR扩增[14]，扩增目的DNA片段长度342 bp，覆盖81 bp的RRDR区域。反应体系共50 μL，包括2×Taq PCR Master Mix (康为世纪) 25 μL、引物(10 μmol/L) 各1.5 μL，模板5 μL，去离子水17 μL。扩增条件：94 ℃变性8 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，共35个循环；再72 ℃延伸5 min。PCR产物送生工生物工程(上海) 股份有限公司进行测序。

PARMS技术采用5条引物进行PCR反应，其中2条荧光通用引物包含在2× PARMS Master Mix中。其余3条为标记特异引物，需要根据实验目的定制设计合成。其基因型检测包括两个互补的PCR反应，使用同样的DNA模板、一条相同的共有引物和相同的反应条件，区别在于与共有引物配对的PARMS标记引物不同，从而使两个反应选择性扩增相应的模板。

PCR扩增反应体系10 μL，包含5 μL 2× PARMS master mix，0.15 μL 10 mmol/L每个等位基因特异性引物，0.4 μL 10 mmol/L通用特异性引物和1 μL模板DNA (10–100 ng)。使用荧光定量PCR仪设置降落式PCR：94 ℃ 3 min；94 ℃ 20 s，65 ℃ (–0.8 ℃每个循环) 1 min，10个循环；94 ℃ 20 s，57 ℃ 1 min，30个循环。导出FAM、HEX、ROX荧光强度数据，上传至http://www.snpway.com/snpdecoder/，结合标记信息，获得分型结果。

根据结核耐药基因突变数据库(www. tbdreamdb.com) 的研究表示，rpoB基因511、513、516、522、526、531、533等7个氨基酸位点被认为是高度确信突变位点。同时结合国内关于rpoB突变位点的研究[14-15]，在利福平耐药菌株中存在最多的是531、526、516位点，总占比80%以上，虽然rpoB 511、513、533占比不高，但也属于常见位点。本文中我们总共选择设计了11组分子标记，位点分别为：511 (CTG/CCG)，513 (CAA/CTA)，516 (GAC/GTC, TAC, GAG)，526 (CAC/TAC, GAC, CGC, AAC)，531 (TCG/TTG)，533 (CTG/CCG)。利用这些位点等位基因的差异性为特异性引物的3′末端，设计共显性的分子标记，引物序列见表 1。

Allele引物5′端与FAM荧光匹配的接头序列为GAAGGTGACCAAGTTCATGCT，与HEX荧光匹配的接头序列为GAAGGTCGGAGTCAAC GGATT，在扩增过程中分别与PARMS master Mix中的FAM/HEX荧光引物结合。如表 2所示，根据引物序列对比分析，预测PCR扩增后，对于分子标记T511C、A513C、G516T，利福平敏感菌株一定可以检测到HEX荧光信号，其他耐药菌株可以检测到FAM荧光信号；对于分子标记A516T、C516G、C526G、C526T、C526A、A526G、C531T、T533C，敏感菌株基因扩增后一定可以检测到FAM荧光信号，其他耐药菌株可以检测到HEX荧光信号。通过检测两种荧光信号将耐药菌株与敏感菌株的基因型区分开。

利用设计的11组荧光分子标记检测104例结核样本DNA的基因型，PCR扩增后经荧光扫描、数据分析，结果显示FAM和HEX荧光信号的散点图见图 1。结合PARMS引物设计原理分析，有64例样本为单位点突变(92.75%)，其中rpoB 531 (52.17%) 最多，其次为rpoB 526 (21.74%)、rpoB 516 (13.04%)，这3个位点占总突变的86.95%。另外还存在5株联合突变样本(7.25%)，rpoB 526+533、rpoB 511+516、rpoB 513+531各1例，rpoB 511+526有2例，见表 3。

RFP耐药界限定在≥40 μg/mL，经比例法药物敏感性实验后，结果显示104例临床菌株中RFP耐药菌株74例，敏感菌株30例，分析结果见表 4。将存在突变视为利福平耐药，两种方法相符率为94.23% (98/104)。3例(2.88%) 样本没有检测到rpoB基因突变，却表现为利福平耐药，可能是存在细胞壁通透性障碍，导致药物进入高疏水性细胞壁间隙比较慢；或者是MTB外排泵将药物泵出，导致菌内药物浓度降低，杀菌作用减弱从而导致耐药[16-17]。69例突变样本中3例表现为利福平敏感，分别是rpoB 511单位点突变2例、rpoB 533单位点突变1例。对这3株样本和包含511/533位点突变的4株样本进行利福平MIC测定，结果显示单位点突变样本MIC为10–20 μg/mL，联合突变样本MIC为50–60 μg/mL，具体见表 5。

为检验PARMS分子标记基因分型是否正确，以H37Rv标准株DNA序列作为参比序列，分析104例结核分枝杆菌临床分离株的测序结果。序列对比发现分子标记的分型结果与相应测序结果的符合率为100%，见表 6。同时也明确了2.3中，11组分子标记没有检测到突变的3例RFP耐药菌株存在其他类型的基因突变，为519 del AAC 1例、522 TCG→TTG 2例。

作为耐多药菌株的标志性特征，RFP耐药检测在临床诊断工作中不可或缺，由于表型药物敏感性试验耗时长、敏感度低，目前多采用分子诊断方法来检测RFP耐药相关基因rpoB突变情况。本文使用的PARMS技术作为一种新型的分子标记方法，基于荧光检测，通过特异性引物的设计实现基因型区分，具有操作简便、耗时短、成本低的优势，已成功地应用于农作物的选择性育种和半滑舌鳎的性别鉴定中[11-13, 18-19]。

根据RFP耐药菌株存在的绝大多数rpoB基因突变特征，本文利用PARMS技术开发了11组荧光分子标记联合跟踪rpoB基因突变位点，能精准检测出样本中存在的1个碱基突变，以区分鉴定利福平耐药性，避免了Xpert易被同义突变影响的问题，同时采用的分子信标探针也比DRplus或其他类型的杂交探针都具有更高的特异性[2, 20]。且相对于基因芯片及Sanger测序技术，对实验条件、仪器要求不高，通过荧光信号扫描和软件分析直接获得基因型，荧光定量PCR仪即可完成实验，具有不需要进行杂交分析或DNA电泳的简便性[9]。

本文通过设计的11组分子标记对104例MTB临床分离株进行检测分型，使用测序法进行验证，符合率为100%。与比例法药敏结果相比符合率为94.23%。差异原因为：(1) 3株样本比例法药敏结果为RFP耐药，但分子标记未检测到突变, 经测序证实为519 del AAC一株，522 TCG→TTG两株，原因是设计分子标记时忽略了这些通常出现率＜0.09%的突变位点[14-15, 21]；(2) 3株样本rpoB 511/533单位点突变但比例法药敏结果显示为敏感，同时511/533与其他位点联合突变的4株样本显示为耐药。MIC检测的结果表明：单位点突变样本中1株MIC为10 μg/mL，2株MIC为20 μg/mL；4例联合突变菌株显示1株MIC为50 μg/mL，3株MIC为60 μg/mL耐药。也就是说rpoB 511/533位点突变可能会导致低浓度耐药，而联合突变样本中由于存在526或531等相关位点突变，对耐药调控机制造成了影响，导致药敏结果的不同。杨慧娟等和李国利等的研究也提示了这一问题，因此通过分子标记方法聚合MTB中多个相关基因，是精确检测RFP基因型耐药的有效途径[14, 22]。

本文建立了利用PARMS技术联合检测rpoB基因11种碱基突变的荧光分子标记方法，对104例临床结核分离株进行基因型检测，并与菌株利福平药敏试验和DNA测序结果进行了对比验证，证明了该荧光分子标记的有效性，为临床精准快速检测结核RFP耐药提供了一种新方法。不足之处在于，尽管本方法已包含11种利福平耐药基因特异性突变位点，涵盖了临床约92%–96%的常见结核菌株耐药基因突变类型[14-15]，但对于菌株其他罕见突变、插入、缺失等突变类型不能完全检出。由于临床结核菌株耐药机制产生原因的复杂性，基因突变检测结果与耐药表型结果的符合率也并非100%，在临床诊断条件与时间允许的情况下，可以结合菌株药敏结果进行进一步验证。最后，尽管PARMS技术对大批量精准双等位基因检测有着简便、高效、快速、便宜的优越性，但是要实现多基因位点联合检测并将其应用于临床诊断，还需要解决医院实验室硬件条件与操作人员技术培训等问题。我们将进一步将该方法与微流控阵列芯片法相结合，在一张芯片预置试剂，自动控制，使其只需一次样本加入、一次荧光扫描即可实现多位点检测，从而推动分子检测研究工作的发展[21]。

利用PARMS技术结合利福平耐药相关基因rpoB的等位分析，建立了11组rpoB基因的荧光分子标记。利用该标记检测了104份结核分枝杆菌临床分离株的基因型，结合利福平比例法表型药敏试验与测序验证，证明了建立的11组荧光分子标记能够快速、可靠地对结核菌株rpoB基因分型检测，鉴定利福平耐药性，同时为快速检测结核分枝杆菌利福平耐药提供新思路。