实验指南

一、实验目的

1.掌握从土壤中分离微生物的方法。

2.掌握常用的分离纯化微生物的基本操作技术。

二、实验原理

纯种分离技术是微生物学中重要的、常用的基本技术之一。分离即从混杂的多种微生物群体中获得某单一菌株纯培养的方法。纯种(纯培养)即一株菌种或一个培养物中所有的细胞或孢子都是由一个细胞分裂、繁殖而产生的后代。微生物的分离与纯化技术的应用包括分离具有某种特殊功能的微生物、优良菌种及纯化被污染的菌种等。

土壤是微生物生活最适宜的环境，是微生物生活的大本营，它具有微生物所需要的一切营养物质和微生物进行生长繁殖及生存的各种条件，所以土壤中微生物的数量和种类都很多。

土壤中微生物的活动对土壤形成、土壤肥力和作物生长都有非常重要的作用。因此，分析土壤中微生物的数量和组成情况，对发掘土壤微生物资源和对土壤微生物实行定向控制无疑是十分必要的。

微生物的分离纯化主要是根据某微生物的生长条件(营养、酸碱度、温度和氧气等)供给它适宜的培养条件，或加入某种抑制剂造成只利于该菌生长而抑制其他菌生长的条件;用稀释涂布平板法获得单菌落(并不能绝对保证是纯培养，需要结合观察其菌落特征、个体特征，进一步分离纯化)。

三、实验材料

1.土样

选择某一生境土壤，去表层土，挖5~10cm深度的土壤数克，装入已灭菌的牛皮纸袋。

2.培养基

牛肉膏蛋白胨培养基，培养细菌;高氏1号培养基，培养放线菌;孟加拉红培养基，培养霉菌。

四、实验步骤

1.倒平板

2.制备土壤稀释液(图1)10g土样+90mL无菌水→振荡10min，为稀释10倍的样品。

取1m土壤菌悬液移人含9ml无菌水的试管中，吹吸均匀为稀释100倍的样品，依次进行梯度稀释10^-2~10^-5。

图1、土壤悬液稀释及菌体数量

3.接种

(1)涂布

如图2，取0.1mL菌悬液滴在平板表面中央位置，右手拿无菌涂布器放于平板表面，将菌液先沿一条直线轻轻来回推动使之分布均匀，然后改变方向沿另一垂直线来回推动。

图2、土壤悬液涂布

悬液涂布:无菌操作，从稀至浓将菌液涂布均匀。细菌牛肉蛋白胨平板采用10^-4、10^-5稀释液。放线菌(高氏1号平板)和霉菌(孟加拉红平板)采用10^-3、10^-4稀释液。

(2)平板画线分离法。

在近火焰处，左手拿皿底，右手拿接种环，用接种环挑取上述10^-1的土壤悬液一环，在相应培养基平板中画线分离，目的是获取单个菌落，有连续画线和分区画线两种方式(下图A和B)。

图3、平板画线分离法

4.培养

将细菌、真菌、放线菌培养基倒置于37℃、30℃、28℃培养箱中培养2 ~7d。

5.挑菌落(纯化)

将培养后长出的单菌落数量、形态、培养特征进行观察。分别挑取单菌落接种于对应培养基上，待菌苔长出，检查菌落是否一致、单纯。用显微镜涂片染色镜检是否是单一的微生物，如有杂菌需进一步纯化、分离

五、注意事项

1.一般土壤中，细菌数量最多，其次为放线菌和霉菌，而酵母菌主要分布于果园及菜园土壤中，所以从土壤中分离细菌时，要取较高的稀释度，否则菌落连成菌苔无法计数。

2.放线菌的培养时间较长，故制平板的培养基用量可适当增加。

六、实验结果

将实验结果填入下表:

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