99%的人都不知道的WB制胶技巧及常见问题（附解决方法）

有很多同学会有疑问，为什么别人跑出来的条带又清晰又好看，其实western blot的每一步实验都很关键，今天我们就来讲讲最基础的配胶，制胶虽然简单基础但是对最终实验结果的影响却非常大。

一、SDS PAGE 凝胶制备步骤

1、玻璃板梳子的清洁

先用自来水浸泡5分钟，洗洁精清洗，注意厚玻璃板两侧沟槽容易残留胶，可以用尖锐的东西轻刮，然后用自来水冲洗干净泡沫，再用纯水冲洗即可，37度烘干或者吹风筒吹干，注意别用热风长时间近距离吹，厚玻璃板两侧的边条是用粘胶粘在一起的，高热会使粘胶融化，久而久之可能引起密闭性不良甚至边条脱落。

2、制胶试剂准备

超纯水，30%丙烯酰胺，pH8.8Tris-HCl，pH6.8Tris-HCl，10%SDS，10%过硫酸铵（APS），TEMED，还有95%酒精（压胶用）。注意试剂的有效期，是否澄清透明，若有沉淀或晶体析出，请更换。30%丙烯酰胺注意避光4度保存。pH8.8Tris-HCl和pH6.8Tris-HCl容易出现沉淀，另外注意这两个试剂有两个浓度的，分别是1.0M和1.5M，根据你的配方表来买。10%SDS低温（4度以下）时容易结晶析出。APS化学性质活泼，常温下暴露于空气下容易变质失效，一般建议配好后分装冻于-20度冰箱。TEMED气味恶臭，挥发性强，具有神经毒性，使用时屏住呼吸，在通风的环境下使用，注意密闭避光保存于4度。

参考1 不同凝胶浓度所适合的分离蛋白的分子量和线性分离范围

3、制备分离胶

按照配方表依次加入相应体积的试剂（1.0mm玻璃板一块胶总体积5.0ml，1.5mm玻璃板一块胶总体积7.5ml），加完SDS后加APS前可以先混匀，然后迅速加入APS和TEMED,马上混匀（手摇或者振荡器摇匀），灌胶，注意胶的高度，要留有足够的空间给压缩胶，一般压缩胶的深度要求是梳子下缘再往下1厘米左右。然后用95%酒精压胶，注意加酒精时要缓缓注入，并且要边加边移动枪嘴，以免酒精在同一位置冲出一个凹陷。室温静置25分钟。

参考2 不同浓度分离胶配方 (10 mL)

4、制备压缩胶及插梳子

先判断下层胶是否已经凝固，然后倒掉酒精，再用吸水纸吸干残余酒精，注意纸不能戳到胶面。然后按步骤3操作，混匀上层胶试剂后迅速灌胶，可以直接倒，但要注意别倒多了导致其他玻璃板不够，然后迅速插梳子，一次性操作，不可拔出再插。室温静置20分钟。

参考3 浓缩胶配方 (10 mL)

5、凝胶的暂存

根据剩余在离心管中的上层胶是否已经凝固来判断玻璃板中的上层胶是否已经凝了。确认无误后小心取下玻璃板，用保鲜膜包裹，每块玻璃板分别包，然后浸泡于纯水中置于4度冰箱保存。一般不要放置不要超过一周。

二、常见问题点及其对策

1、漏胶

90%以上都是由于玻璃板没对齐所致，技巧一:玻璃板一定要干燥，因为有水玻璃板会吸得很紧，不容易对齐。另外手法技巧是:一手食指指腹按压厚玻璃板一侧上缘，拇指指腹按压薄玻璃板同侧上缘，两指向下按压的同时另一手锁上同侧锁扣，同样的手法锁另一侧。还有一种漏胶的原因是玻璃板底部缺损，厚玻璃板边条密闭性不良，塑料夹子太松等。

2、胶不凝

99%以上都是因为APS失效了，注意事项在第一部分的步骤2中详述过。其他原因也可能是TEMED失效或者胶没凝好就被晃动过了。

3、胶凝得不均匀

玻璃板没洗干净，表面有灰尘等杂质，试剂有沉淀，没混匀，APS变质，加酒精冲得太快，酒精没干透等。

4、胶中有气泡

两种情况，一是下层胶有自底部向上出现的成串气泡，这是由于胶垫材质(类似海绵，胶垫在被挤压时气体冒进胶中)所致，改用实心的软胶垫或者加一层保鲜膜。另一种是梳子下缘有气泡，这是梳子插得不好，技巧是先插一侧，再插另一侧。

5、上层胶边缘有缺损

这是由于该侧的厚玻璃板边条密闭性不良所致，原因在第一部分的步骤1提过，也有可能长期使用粘胶被腐蚀所致。

6、拔梳子后泳道有胶丝

这是因为TEMED的量太多导致胶凝得太快，插梳子之前胶已经部分凝固。然后减少五分之一的TEMED即可解决这个问题，至今再没碰过类似情况了。

7、拔梳子后泳道歪了

梳子与玻璃板不匹配，不同公司生产的规格或多或少有差别，当梳子厚度比玻璃板内径稍大时，插或者拔都觉得很费劲，这时极易出现拔梳子泳道变歪，解决办法，在未灌胶前先试梳子是否匹配。

8、上层胶中电泳出现"漏样"

这个问题更是困扰过不少同学，原因有两个，一是玻璃板与胶局部分离产生了缝隙，要注意取玻璃板（带有胶）时小心，不能有分离玻璃板与胶的动作；保存胶时注意不要将两块玻璃板直接接触，否则在取出来时由于两玻璃板之间充满液体，在大气压下吸得很紧，分开时容易将胶与玻璃板分离；拔梳子时也要小心，动作要轻；上样时也要注意，不能将枪头插得太深，以防将胶与玻璃板撑分离了。配的比较好的胶，梳子下无气泡，分界处呈现一条笔直的折光线，各处均质透明。

实验所需试剂

货号

试剂名称-(GBCBIO)

G5550

30%丙烯酰胺/甲叉双丙烯酰胺(29:1)|30%Acrylamide

G3407

1M Tris-HCl,pH6.8

G3419

1.5M Tris-HCl,pH8.8

04861

过硫酸铵APS|Ammonium persulfate

07611

四甲基乙二胺|TEMED

G3402N

PAGE凝胶快速配制试剂盒|PAGE Gel Quick Preparation Kit

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