分子生物学

DNA双螺旋结构模型的建立为DNA自我复制机制做了初步解释，即碱基互补---两条链互补，碱基配对---模板式复制

为了保证遗传的稳定性，在每次细胞分裂之前，遗传信息载体必须精确地复制自己，遗传信息的载体是DNA，但许多病毒的遗传信息载体是RNA而不是DNA。DNA复制涉及拓扑异构酶，解旋酶，单链结合蛋白，引物合成酶，DNA聚合酶，DNA连接酶

原核细胞是研究DNA复制的最佳实验系统，因为它的细胞比较小，生活周期短，易在人工条件下培养，且原核生物易获得各种突变体。

DNA复制（replication）是在亲代双链DNA分子的每一条链上按碱基互补配对而准确地合成一条新的互补链，结果生成两个与亲代链相同的DNA双链的过程。由于每个子代DNA的一条链来自亲代DNA，另一条链则是新合成的。这种复制方式称为半保留复制(semi-conservation replication)

1）复制起点：DNA复制是从DNA分子上特定位置（原点，origin）开始，此位置称复制起点(Origin of replication，ori)，大多数原核生物基因组和细菌质粒只有一个Ori位点，而真核生物染色体中有多个Ori。从细菌，酵母，线粒体，叶绿体中鉴定出的复制起始点的共同特点是含有丰富的AT序列。

2）复制方向：DNA可进行单向和双向复制，大多数DNA的复制是双向的。DNA正在复制的分叉部位称为复制叉（replication fork）

概念：在复制起点两条链解开形成复制泡(replication bubbles)，DNA向两侧复制形成两个复制叉(replication forks)。以复制叉移动的方向为基准，一条模板链是3’→5’，以此为模板的新生DNA链合成沿5’→3’方向连续进行，这条链称前导链(leading strand)。另一条模板链的方向为5’→3’，以此为模板的新链合成方向也是5’→3’，但与复制叉前进方向相反，且是分段的不连续合成，这条链称滞后链(lagging strand)，合成的片段为冈崎片段(Okaxaki fragments)。冈崎片段由DNA连接酶连成完整的DNA链

DNA双螺旋的两条链是反向平行的，因此，在复制起点处两条DNA链解开成单链时，一条是5’→3’方向，另一条是3’→5’方向。DNA复制时，新生链延伸方向一条为3’→5’，另一条为5’→3’。但生物细胞内所有催化DNA聚合酶都只能催化5’→3’延伸。

概念：复制子或复制单元是基因组中具有一个复制起点（origin, ori）和一个复制终点（terminus, ter）并能在细胞中自主复制的单位。原核生物中，只有一个复制原点，每个DNA分子上只有一个复制子。真核生物中，每个DNA分子有多个复制子，其DNA复制是由多个复制子共同完成的。每个细胞中，染色体DNA复制子一般只复制一次。

1）染色体外遗传元件的复制子：染色体外遗传元件包括：原核生物细胞中的质粒和噬菌体；真核生物细胞中的线粒体、叶绿体和病毒的DNA。染色体外遗传元件一般为单复制子（只有一个origin），但为多次复制，为多拷贝。真核生物的线粒体和叶绿体复制一般与核DNA同步或稍滞后；原核生物的染色体DNA和质粒（噬菌体）一般不同步，但整合后同步。质粒为双向复制。

体外复制实验证明，新合成DNA的特异性完全取决于事先加入的模板DNA。三磷酸核苷酸(dNTP)是合成原料。

细胞内还有许多酶和蛋白质参与DNA的复制

1）解旋酶(Helicase)

DNA复制时，解旋酶在ATP的作用下可促使DNA母链不断解开形成单链。

2）单链DNA结合蛋白(SSB)

解旋酶沿复制叉方向推进产生了一段单链区，细胞内大量的单链DNA结合蛋白(single strand DNA binding protein SSB)能和单链DNA结合，防止其重新配对形成双链DNA。SSB与解旋酶不同，它不具备酶的活性。

SSB的作用：使DNA单链保持一种伸展构象，作为模板；使解开的单链不形成发卡结构；保护DNA单链不受Dnase水解。

3）DNA拓扑异构酶(DNA Topisomerase)

拓扑异构体（topoisomer)：具有不同螺旋数的同一DNA分子两种异构体。

拓扑异构酶：可使DNA的两种拓扑异构体互变的酶。

拓扑异构酶的功能：与DNA形成共价结合中间体，使DNA磷酸二酯键断裂，形成DNA nick，DNA的一条链进行解旋，旋转而改变DNA分子的拓扑状态。

拓扑异构酶可使DNA发生连环化（catenate）、脱连环化（decatenate）、打结（knot）和解结（unknot），参与DNA的复制、转录的重组等过程。

原核生物的拓扑异构酶分为I型（酶与DNA结合使双链解旋；使一条链切开，但酶与切口的两端结合阻止了螺旋的旋转；酶使另一条链经过缺口，然后再将两断端连接起来；酶从DNA上脱落，两条链复原，得到的DNA比原来少一个负超螺旋）和II型（也称旋转酶，广泛存在于各种生物中。使正超螺旋转化为负超螺旋，每次改变两个连接数）

真核生物拓扑异构酶也是分为I型和II型

1）引物酶（Primase）

引物酶以单链DNA为模板，利用核糖核苷酸合成RNA（6~10nt）作为DNA合成的引物。接着由DNA聚合酶从RNA引物3'端开始合成新的DNA链。前导链和后随链都需要合成RNA引物，只是前导链相对简单，后随链比较复杂。引物的意义在于减少致死突变。DNA合成中最初几个核苷酸正确性远比其后的低。引物RNA随后被降解，从而减少了复制错误。

复制的延伸，前导链和后随链是同步的，前导链持续合成，由全酶异二聚体中的一个亚单位和前导链模板结合，在引物RNA合成的基础上，连续合成新的DNA。后随链的合成分段进行，形成中间产物冈崎片段，再通过共价连接成一条连续完整的新DNA链。

除Tus蛋白以外，链的终止看起来不需要太多蛋白质的参与。当复制叉前移，遇到约22个碱基的重复性终止序列( Ter)时，Ter-Tus复合物能使DnaB不再将DNA解链，阻止复制叉的继续前移，等到相反方向的复制叉到达后停止复制，其间仍有50-100bp未被复制，由DNA修复机制填补。其后两条链解开。在DNA拓扑异构酶Ⅳ的作用下使复制叉解体，释放子链DNA。

DNA聚合酶以dNTP（核苷酸三磷酸）为前体催化合成DNA，需要模板和引物，且不能起始合成新的DNA链，可以催化dNTP加到生长中DNA链的3‘-OH末端，催化合成的方向是5’-3‘。这个酶被认为在切除由紫外线照射而形成的嘧啶二聚体中起着重要作用，也可以用于出去冈崎片段5’端RNA引物，使冈崎片段间缺口消失，保证连接酶将片段连接起来。

真核生物每条染色体上可以有多处起始点，而原核生物只有一个起始点。真核生物的染色体在全部完成复制之前，各个起始点上DNA的复制不能再开始，而在快速生长的原核生物中，复制起始点上可以连续开始新的DNA复制，表现为虽只有一个复制单元，但可有多个复制叉。

把酵母的复制起始点称为自主复制序列( autonomously replicating sequence, ARS)。其他真核生物中也有类似酵母ARS元件的顺序。不同ARS序列的共同特征是具有一个被称为A区的11个A-T碱基对的保守序列。真核生物复制的起始需要起始点识别复合物  ( origin recongnition complex , ORC)参与，ORC结合于ARS。

真核细胞的DNA聚合酶和细菌DNA聚合酶基本性质相同，均以dNTP为底物，需要Mg离子激活，聚合时必须有模板链和具有3'-OH末端的引物链。链的延伸方向为5'-3'。但真核细胞的DNA聚合酶一般都不具有核酸外切酶活性，推测一定有另外的酶在DNA复制中起校对作用。

DNA聚合酶α的功能主要是引物合成，即能起始前导链和后随链的合成，它与引发酶( primase)形成复合体，因其具有引发，延伸的双重功能，所以被称为pol α 的引发酶。

具有较多复制叉，染色体的复制与细胞分裂一般是同步的，但复制与细胞分裂不直接偶联，复制终止能引发细胞分裂。对于大肠杆菌来说，DNA复制的调控主要发生在起始阶段，一旦开始复制，如果没有意外阻力，就可以一直复制下去直到完成。大肠杆菌复制起点有oriC和oriH两种，其中oriC是首选的复制起始点。

真核细胞的生活周期可分为4个时期：G1,S,  G2,M期。G1是复制预备期，S期为复制期，G2为有丝分裂准备期，M为有丝分裂期。DNA复制只发生在S期，真核细胞中DNA复制有3个水平的调控：细胞生活周期水平调控  也称为限制点调控，即决定细胞停留在G1期还是进入S期； 染色体水平调控  决定复制子按一定顺序在S期起始复制；复制子水平调控  决定复制的起始与否。这种调控从单细胞到高等生物是高度保守的。此外，真核生物复制起始还包括转录活化，复制起始复合物的合成和引物合成阶段，许多参与复制起始蛋白的功能与原核生物中相类似。

DNA子链中的错配几乎完全能被修复。错配修复中母链起重要作用，该系统识别母链的依据来自于Dam甲基化酶，它能使位于5'-GATC序列中腺苷酸N⒍位甲基化。此后，只要两条DNA链上碱基配对出现错误，错配修复系统就会根据"保存母链，修正子链"的原则，找出错误碱基所在的DNA链，并在对应于DNA切口的方位启动下图所示两条修复途径之一，合成新的子链DNA片段。

碱基切除修复，所有细胞都带有不同类型、能识别受损核酸位点的糖苷水解酶，它能特异性切除受损核苷酸上的N-β糖苷键，在DNA链上形成去嘌呤或嘧啶位点，统称为AP位点。一类DNA糖苷水解酶一般只对应于某一特定类型的损伤，如尿嘧啶糖苷水解酶就特异识别DNA中胞嘧啶自发脱氨形成的尿嘧啶，而不会水解RNA分子中尿嘧啶上的N-β糖苷键。

核苷酸切除修复，当DNA链上相应位置的核苷酸发生损伤，导致双链之间无法形成氢键，则由核苷酸切除修复系统负责修复。下图分别是大肠杆菌(左)和人类细胞(右)中的修复过程。损伤发生后，首先由DNA切割酶在已损伤的核苷酸的5'和3'位分别切开磷酸糖苷键，产生一个由12~13个核苷酸(原核生物)或27~29个核苷酸(人类或其他高等真核生物)的小片段，移去小片段后由DNA聚合酶Ⅰ(原核)或ε(真核)合成新的片段。并由DNA连接酶完成修复中的最后一道工序。

又被称为"复制后修复"，它发生在复制之后，机体细胞对在复制起始时尚未修复的DNA损伤部位可以先复制再修复，即跳过该损伤部位，在新合成链中留下一个对应于损伤序列的缺口，该缺口由DNA重组来修复：先从同源DNA母链上将相应核苷酸序列片段移至子链缺口处，然后再用新合成的序列补上母链空缺。

生物体内还存在多种DNA损伤以后直接修复而并不需要切除碱基或核苷酸的机制。例如：DNA光解酶的作用下把光下经紫外线照射形成的环丁烷胸腺嘧啶二聚体及6-4光化物还原成单体的过程。

细胞DNA受到损伤或复制系统受到抑制的紧急情况下，细胞为求生存而产生哦一种应急措施。SOS反应包括诱导DNA损伤修复，诱变效应，细胞分裂的抑制以及溶原性细菌释放噬菌体等，细胞癌变也与SOS反应有关。