使细胞同步化胸腺嘧啶核苷双阻断法

使细胞同步化在G1/S期交接点的方法主要是抑制DNA的合成。所用DNA合成抑制剂有艾菲迪克宁（aphidicolin )、羟基脲（hydroxyurea）等。胸腺嘧啶核苷酸（thymidine, TdR)是DNA合成不可缺少的前体物，但如果在培养基中过量（含2mmol/L或以上）时，胞内dTTP池浓度上升约5倍，高浓度的dTTP反馈性地抑制其他核苷酸的磷酸化，抑制了从CDP变为dCDP，从而能产生阻抑DNA的合成效应。

【材料】

1．培养细胞对数生长期细胞（如Vero细胞）。

2．试剂胸苷用PBS制备胸苷母液（100mmol/L, pH7.4 )，过滤除菌（或高压灭菌）后，置于-20℃或-80℃冰箱冻存、备用。

3．仪器离心机、C02培养箱、流式细胞仪等。

【方法】

1．取培养处于指数生长期的悬浮细胞，用含有2mmo1/L胸苷的新鲜培养液将细胞浓度稀释至2.5×105个／ml,37℃继续培养12小时。这段时间内G2/M期的细胞将会进入G1期，会同原有在G1期的细胞一起进入相当于G1/S期边界的状态（G2/M期=3.6小时，G期=8.4小时，共12小时）。任何处于S期的细胞于加入胸苷后都将停滞在S期里。

2．将培养12小时的悬浮细胞以1500r/min离心5分钟，弃去含有胸苷的上清液，用等量预热的新鲜培养液洗2次，以解除胸苷的阻滞，将细胞重新悬浮成细胞悬液。（贴壁单层细胞可直接倒掉含有胸苷的培养液以除去胸苷，在单层细胞上加入新鲜培养液，冲洗培养瓶细胞后倒掉培养液，再用新鲜培养液洗细胞2次。）

3．接种到培养瓶中继续培养14～16小时。已从胸苷阻滞中重新生长在新鲜培养液的细胞，逐渐得到恢复（约12小时）而进入细胞周期，细胞分裂并进入下一个周期的G1期。进入G1期的细胞将与停留在前一个细胞周期S期末的细胞汇合。

4．细胞培养16小时后，在培养液中再次加入胸苷，使终浓度为2mmol/L，将细胞稀释至2.5×105个／ml，培养12～14小时。此时处于G2/M或G1期的细胞都将进入并停滞在G1/S期边界。

5．用步骤2的方法洗细胞，以去除再次胸苷的作用。接种入另一培养瓶内，置37℃培养箱中培养。细胞将进入同步生长状态。（单层贴壁细胞可用胰蛋白酶溶液消化后，换新鲜培养液，1000r/min离心5小时，洗2次，制成细胞悬液，此时细胞进入并停止在G1/S边界。）

【结果】

可在再次加入胸苷8～10小时后，用流式细胞仪测知细胞周期的位置。这将确定细胞群体充分同步化，再次加入含过量胸苷培养液培养时，细胞大都被停滞在G1/S期边界。