不同光照强度对小球藻生长的影响

小球藻(Chorella vulgaris)是一类普生性单细胞绿藻，属于绿藻门(Chlorophyta)、绿藻纲(Chlorophyceae)、小球藻科(Chorella vulgarisceae)[1]。小球藻生态分布广，并具有易于培养、生长速度快等优点，是进行生物技术研究的很好材料，而且富含蛋白质、生物活性物质以及微量元素等多种营养物质，在环保、医药保健、食品、养殖业等领域里具有较高应用价值[2]。因此，小球藻最适培养条件的研究是提高其生物质产量和促进其资源化高效利用的关键，也是当前微藻研究的一个重要领域[3]。目前，国内外关于小球藻培养条件的研究很多，其中关于对小球藻最适光照强度的研究较少，而光对于藻类来说是其进行光合作用的主要能量来源[4]，在一定pH、温度和营养条件下，光照的强弱和时间的长短决定着藻类光合作用的效率，对藻类的生长、形态结构、光合作用和物质代谢等方面具有一定的调控作用[5]。因此，本研究试图探究不同光照强度对小球藻生长的影响，旨在为其优化培养条件和工业化生产生物能源提供一定科学依据。

普通小球藻(Chorella vulgaris)，采用划线培养方法从香溪河藻种中分离纯化[6]而来。采取自养培养方式，用BG-11培养液[7]扩大培养小球藻。达到指数生长期后，取适量藻液于3 000 r/min离心5 min，去除上清液，再用15 mg/L的Na2CO3溶液清洗后再次离心，重复3次[8]，用于接种。

实验容器均为外径5 cm、内径为4.6 cm，长度为100 cm的长玻璃管。玻璃管中注入BG-11培养液1 L，采用多排密集日光灯管提供光照强度，均设置6个光照强度，即0、1 000、3 000、5 500、7 000、9 000 (分别依次简称为1号、2号、3号、 4号、5号、6号)。培养温度为20 °C，同时采用 24 h不间断曝气，曝气强度为20% (曝气体积占原体积的20%)[3]。在长玻璃管中加入等量处理后的藻液。为保证结果的可靠性，每个梯度均设置2个平行样。培养方式为一次性培养，培养时间为9 d，每隔24 h定时取样，连续观测9 d。

每天9:00进行相关指标测定及取样，光照强度采用AS813照度计(1−100 000 lx)测定；温度采用普通温度计；pH采用pH计来测定；光密度OD用紫外可见分光光度计测定小球藻活体细胞在680 nm处的吸光度换算[9-10]；叶绿素a用紫外可见分光光度计测定；DTN (溶解性总氮)、DTP (溶解性总磷)采用全自动间断化学分析仪测定。考虑紫外可见分光光度计的测量范围和实验误差等因素，取样10 ml，稀释25倍后测定OD、叶绿素a浓度及藻密度等指标。由于取样和蒸发将导致各强度水样损失，为维持营养盐浓度基本不变，使营养盐绝对充足，因此每次采样结束后用BG-11培养基将玻璃管中培养液补充至1 L。

藻类比增长率，计算公式为[11]：

式中：μ为藻类比增长率；Nt为第t天光密度；N0为初始光密度；∆t为初始至第t天的时间(d)。各指标测定参考《水和废水监测分析方法》(第4版)[12]和《湖泊生态调查观测与分析》[13]。

实验期间，每天利用照度计读取各强度下的光照强度，用于判断实际值与设计值之间是否存在差异(图 1)。结果显示，各梯度下光照强度控制效果较好，实际值与理论值的标准偏差在100 lx以内。最大标准偏差为64.084 lx，最小标准偏差为43.868 lx；1号至6号下的光照强度相对误差分别为0、8.600%、4.500%、2.527%、1.829%、1.539%，从数据上看，实际光照强度波动范围极小，可忽略其影响。因此，本实验光照强度设计值能有效代表理论值，则不同的光照强度是小球藻生物量差异的影响因素。

2.2.1 光密度值： 图 2为不同光照强度下光密度(OD)的变化特性。由图 2可知，不同光照强度下，小球藻OD差异较大，各强度(除0 lx强度)下OD变化趋势相近，随培养时间的增加，OD逐渐增大，后期逐渐稳定。初始OD均为0.15。实验初期，各强度(除0 lx强度)下OD上升速度较快，此后OD增长幅度较小，变化较为平缓。5 500 lx下小球藻生长良好，其OD值高于其他强度，第5天OD达到最大，为4.625。而0 lx下的ODmax出现在第 1天，随后该强度下OD逐渐降低，这是由于长期处于黑暗环境，无法吸收光进行光合作用，死亡速率大于生长速率，小球藻生物量降低，OD下降，至实验结束时降低至0.089。从数据上看，各强度ODmax顺序依次为5 500 lx>7 000 lx>3 000 lx> 9 000 lx>1 000 lx>0 lx。

同时，小球藻在高光照强度下生长也较好。在7 000 lx光强下，前3天小球藻生长趋势与5 500 lx下最相近，第4天生长较缓，第6天OD达到最大值3.775，后期趋于稳定。在9 000 lx条件下，OD在第5天达到最大值2.775，与5 500 lx和7 000 lx相比，其生长趋势明显较缓，可见光照过强，小球藻生长会受到光抑制作用。

2.2.2 叶绿素a浓度及其与光密度的关系： 由图 3可知，不同光照强度下，小球藻叶绿素a差异较大，但都呈现出先升高后降低的趋势。实验初期，各光照强度下叶绿素a浓度较低，实验前3天各强度叶绿素a浓度大幅度上升，5 500 lx强度下叶绿素a浓度高于其他强度，至实验结束时叶绿素a浓度达到2 297.538 mg/L。其他光照强度下，叶绿素a浓度均相对较低。0 lx强度下的小球藻死亡速率大于生长速率，叶绿素a浓度下降，实验结束时仅为17.738 mg/L。

叶绿素a浓度与OD变化趋势较为一致，通过线性回归可得两者线性关系显著(R2=0.853 2) ，见图 4。

2.2.3 藻密度及其与光密度的关系： 由图 5可知，不同光照强度下，小球藻藻密度差异较大，各强度下(除0 lx强度)藻密度变化趋势相近，随培养时间的增加，藻密度逐渐增大，后期逐渐稳定。5 500 lx强度下小球藻生长良好，其藻密度值高于其他强度，第5天藻密度达到最大，为10 233×104 cells/ml，而0 lx强度下的小球藻由于长期处于黑暗环境，无法吸收光进行光合作用，死亡速率大于生长速率，小球藻生物量降低，藻密度下降。

结合图 2、3可知，藻密度与OD变化趋势几乎一致，与叶绿素a趋势也较为相近。通过线性回归可得两者线性关系十分显著，见图 6。藻密度与光密度OD相关性图中R2=0.964 3，可见藻密度与光密度之间密切相关。藻密度与叶绿素a相关性图中R2=0.848 2，小于藻密度与光密度之间的相关性值，这可能是因为叶绿素a浓度达到最大值后即开始下降，不像细胞数量一样在较高浓度仍然维持一定水平[14]。

实验采用BG-11培养液提供营养物质，实验初期各强度下的DTN含量为247 mg/L，DTP含量为 7.13 mg/L。如图 7所示，可知光照强度较高时，营养盐消耗较多也较快。在光照强度为1 000 lx时，实验时间越长，营养盐消耗越多，这可能是因为连续的低光照对小球藻的生长有诱导作用。WestLake认为在河流里当P>0.03 mg/L且N>1 mg/L时就不存在限制元素[15]。而在本实验中，由于每日取样结束后会补充培养液，DTN含量最低值为90.74 mg/L，DTP含量最低值为0.09 mg/L，均出现于实验第 8天的5 500 lx光照强度下，结合叶绿素a和藻密度数据分析可知，第8天各梯度小球藻的生长已趋于稳定，可以推断实验最后小球藻生长缓慢甚至死亡的限制因素不是营养盐的缺失，而是因为受到不同光照强度的影响其本身生长已达到稳定期。

藻液中的pH值会影响小球藻的光合作用及其对磷和无机碳的有效利用，同时还会影响其代谢产物的再利用性和毒性，pH值是影响藻类生长代谢的重要因子之一[16]。实验过程中，不同光照强度下的pH变化特性如图 8所示。由图 8可知，各强度pH在7.3−9.5之间变化，不同强度间pH差异较大，除了0 lx强度外，其余各强度下的pH大约在前 5天先上升，后下降至趋于稳定。其中5 500 lx强度下的pH值在第5天最大为9.5。结合图 2、图 3及图 4分析看出，pH变化趋势与OD、叶绿素a和藻密度相近，由此可知pH随生物量的增加而升高，小球藻也较适宜中性偏碱的环境。

图 9为不同光照强度下的比增长率μ的变化特性。由图 9可知，各强度μ (除0 lx)变化趋势一致，均随时间变化μ先逐渐升高再逐渐降低。0 lx下的藻类比增长率μ小于0，小球藻死亡速率大于生长速率，藻类呈负增长趋势。1 000、3 000、5 500和7 000 lx下的μmax出现在第4天，而9 000 lx强度下的μmax在第5天达到最大值，5 500 lx和7 000 lx强度下的μmax差异较小，3 000、9 000 lx下μmax也相近，但与5 500 lx和7 000 lx下相比差异较大。另外，结合图 2和图 9可知，各光照强度间比增长率μ大小变化趋势与OD变化趋势较相近。这是因为初始OD值相对较低，藻细胞密度较小，各个细胞均能接受光照进行光合作用，而且每天的营养盐绝对充足，因此实验初期μ先逐渐升高，且小球藻增长速率较快。随着小球藻生长，藻细胞密度增高，藻液颜色变浓，相互细胞遮光效果增高，产生光限制现象[17]，一部分藻细胞无法接收有效的光强进行光合作用，小球藻生长速率变小，μ逐渐降低。而高光照强度下的小球藻遮光影响相对较小，接受光照的藻细胞数目高于低光照强度，实验期间5 500 lx强度下的μ高于其他强度。所以，5 500 lx强度下的小球藻生长速率最快。

光是藻类进行光合作用的主要能量来源，当光照强度太强，会导致光合色素的光氧化和细胞中的某些酶受到氧化伤害而使光合作用速率下降，因而存在一个适宜的光照强度[18]。实验中，不同光照强度下的小球藻最大ODmax、最大比增长率μmax及出现时间各不相同，如表 1所示。

若考虑小球藻的最终生物量，以OD为评价指标，在本实验光照强度围内，5 500 lx强度下的小球藻的累计生物量最大，与初始OD差异达到4.475。因此，5 500 lx强度下，小球藻生物量最大。

若以μmax为最终评价指标，则1 000、3 000、5 500和7 000 lx下的μmax出现时间较早，值较大，尤以5 500 lx最佳。因此5 500 lx强度下的小球藻生长速率最快。

由表 1可知，不同的光强下小球藻生长差异明显。黑暗条件无法进行光合作用，小球藻停止生长，OD差、μ均为0。低光照强度(0、1 000 lx)下，光合作用受到限制，小球藻生长缓慢，ODmax、μmax较小。而3 000 lx和5 500 lx下，小球藻吸收利用更多的光能，光合效率较高，ODmax、μmax高于低强度光照，对于7 000 lx和9 000 lx强度，光强太高，使小球藻生长受到一定抑制作用，因此适宜小球藻生长的光照范围是3 000−9 000 lx，而5 500 lx下小球藻ODmax、μmax均高于其他强度，则此强度最适合小球藻生长。

由表 1可知，不同光照强度下ODmax、μmax变化趋势并不相同，为了探究光照强度与小球藻生长的适配曲线，将光照强度与ODmax、μmax进行回归分析，结果如图 10所示。光照强度与ODmax、μmax均为抛物线回归曲线，曲线系数R2较高，所拟合得到的曲线关系式能较好地反映不同光照强度与小球藻生长之间的数学关系。

光照强度在0−5 500 lx时ODmax逐渐增大，5 500 lx强度下，ODmax最大，随着光照强度的增大，ODmax逐渐增小。拟合曲线显示光照强度(x)与ODmax的关系式为：ODmax=−1E-07x2+0.001 6x+ 0.105 5 (R2=0.987 2) 。

光照强度在0−5 500 lx区间内时，μmax随光照强度的增加而增大。当光照继续增加，在5 500− 9 000 lx范围内变化时，μmax变化逐渐减小。拟合曲线显示光照强度在5 500−7 000 lx区间内时，小球藻最大比增长率μmax可达到最大值。光照强度(x)与μmax的关系式为：μmax=−2E-08x2+0.000 3x−0.004 2 (R2=0.998 6，0≤x≤9 000 lx)。

(1) 不同光照强度下，小球藻生长差异较大。适宜的光照强度能促进小球藻的生长，在光照强度为0−9 000 lx时，小球藻光密度OD、叶绿素a、藻密度等均呈先增大后减小的变化规律，峰值出现在5 500−7 000 lx。0 lx条件下无法进行光合作用，不适合小球藻生长。

(2) 小球藻生物量会影响培养液的pH值。光照强度适宜时，pH随小球藻生物量的增加而升高，小球藻也较适宜中性偏碱的环境。

(3) 光照强度与光密度ODmax、比增长率μmax均为抛物线回归曲线，曲线系数R2较高，可较好地反应光照强度与小球藻的数学关系。光照强度(x)与ODmax的拟合方程为：ODmax=−1E-07x2+ 0.001 6x+0.105 5 (R2=0.987 2，0≤x≤9 000 lx)，光照强度(x)与μmax的拟合方程为：μmax=−2E-08x2+ 0.000 3x−0.004 2 (R2=0.998 6，0≤x≤9 000 lx)。

(4) 综合考虑各评价指标，认为小球藻最适光照强度为5 500 lx。只要有光照时，小球藻比增长率均大于0，而光照过强时会抑制小球藻生长。