活体动物荧光成像技术原理及应用

一、技术原理

1. 标记原理

活体荧光成像技术主要有三种标记方法。

① 荧光蛋白标记：荧光蛋白适用于标记细胞、病毒、基因等，通常使用的是GFP、EGFP、RFP（DsRed）等；

② 荧光染料标记：荧光染料标记和体外标记方法相同，常用的有Cy3、Cy5、Cy5.5及Cy7，可以标记抗体、多肽、小分子药物等；

③ 量子点标记：量子点（quantum dot)是一种能发射荧光的半导体纳米微晶体，是由数百到数万个原子组成的原子簇，尺寸在100nm以下，外观恰似一极小的点状物。量子点作为一类新型的荧光标记材料，其在长时间生命活动监测及活体示踪方面具有独特的应用优势。与传统的有机荧光试剂相比较，量子点荧光比有机荧光染料的发射光强的20倍，稳定性强100倍以上，具有荧光发光光谱较窄、量子产率高、不易漂白、激发光谱宽、颜色可调，并且光化学稳定性高，不易分解等诸多优点。主要应用在活细胞实时动态荧光观察与成像，可以在长达数天内进行细胞的分化和世系观察, 以及细胞间、细胞内及细胞器间的各种相互作用的原位实时动态示踪。不但如此，量子点还可以标记在其他需要研究的物质上，如药物、特定的生物分子等，示踪其活动及作用。

2. 光学原理

荧光发光是通过激发光激发荧光基团到达高能量状态，而后产生发射光。同生物发光在动物体内的穿透性相似，红光的穿透性在小动物体内比蓝绿光的穿透性要好得多，随着发光信号在体内深度的增加，波长越接近900nm的光线穿透能力越强，同时可消减背景噪音的干扰，近红外荧光为观测生理指标的最佳选择。在实验条件允许的条件下，应尽量选择发射波长较长的荧光蛋白或染料。

二、活体动物荧光成像技术应用领域

1. 肿瘤学

活体荧光成像技术能够无创伤定量检测小鼠的皮下瘤模型。相对于生物发光成像技术，活体荧光成像技术检测时间较快，只需要不到1s的时间，同时不需要注射底物，节约了检测成本。但是需要选择近红外荧光检测深部组织，目前此波段的荧光蛋白种类有限，精确定量较难。

① GFP标记的肺肿瘤模型（H-460-GFP）

H-460-GFP是一个绿色荧光蛋白表达细胞系，它起源于H-460肺小细胞肺癌，稳定转染了绿色荧光蛋白基因，并由SV-40启动子起始基因的表达。

通过H-460-GFP皮下肿瘤模型，建立小鼠肺癌的实验模型，可用来进行有关抗癌药物的筛选（图1）。可用于测量皮下肿瘤的生长和监测对潜在化学治疗药物的反应。

图1  左图是接种后1w荧光成像，右图是3w荧光成像

② 量子点标记细胞系

通过量子点可以标记肿瘤细胞，用量子点Qtracker® 705对MDA-MB-231乳腺癌细胞进行标记，皮下接种后动态观察其生长以及变化（图2）。激发光波长625nm ，散射光波长680nm。

图2 量子点标记肿瘤细胞不同时间荧光成像

2. 抗体

分子探针的一端联有能够和生物体内特异靶点结合的分子结构（如肽类、酶的底物、配体等），另一端则是荧光染料。通过Cy5.5标记的抗体的体内代谢实验，可见肝、肾等处的分布（图3）。

图3  Cy5.5标记的抗体的体内代谢实验

3. 药学研究

荧光成像在药物制剂学研究，尤其是药物靶向性研究，药物载体研究中有巨大优势。有关专家正在设计用合适的荧光染料标记小分子药物，观察药物在动物体内的特异性分布和代谢情况，尤其是中药研究方面。

应用透射仪从样本底部激发光源，可以提高活体荧光成像的灵敏度和检测的深度。图4是应用NIR荧光染料标记的β淀粉酶来观察治疗Alzheimer病的药物的治疗效果，曝光时间仅为200 ms，激发波长680nm，散射光波长720nm。

图4  NIR标记的β淀粉酶成像

4. 组织工程

通过发展EGFP基因表达的细胞系无创伤的评价组织工程的构建。通过EGFP标记的组织工程细胞移植到小鼠体内特制的支架上，观察该细胞的生长和变化，从而判断组织工程的成败与否。

编辑： 陈

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