《食品科学》：吉林工商学院粮食学院张亮副教授：基于磁性纳米颗粒伏马菌素B双探针竞争ELISA检测方法的建立

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伏马菌素为真菌毒素的一种，是由串珠镰刀菌产生的次生代谢产物，主要污染玉米、小麦、玉米制品等。到目前为止，已鉴定出A、B、C和P四种类型的伏马菌素，其中伏马菌素B（FBs）污染最为普遍、毒性最强。因此，建立FBs快速、灵敏、准确的检测方法意义深远。磁性纳米颗粒（MNPs）由于其尺寸均匀、磁性分离、生物兼容性好、高比表面积和可悬浮于溶液中等优点近年来已被广泛应用于生物医学和食品安全等领域。MNPs可与抗体/抗原通过共价键连接在一起。当溶液中存在目标抗原/抗体时，可与MNPs上的抗体/抗原发生特异性结合，并在磁场的作用下与其他物质快速的分离出来。该技术具有液相免疫反应的优点，缩短了检测时间，提高了检测的灵敏度。

吉林工商学院粮食学院的孙宇，孟宪梅，张亮*等在实验中，将修饰的磁性纳米颗粒（MNPs）通过活化酯法活化羧基，直接与带有氨基的FB1进行偶联合成MNPs-FB 1 探针（图1A），采用改良过碘酸钠法合成McAb-HRP探针。应用所合成的两个探针，建立了快速、灵敏检测玉米中FBs的双探针检测方法（图1B）。在所建立的方法中，MNPs-FB 1 探针作为捕获探针，与溶液中的FBs竞争结合McAb-HRP探针上的McAb，形成MNPs-FB1-McAb-HRP，通过磁性分离、洗涤过程，再加入TMB显色溶液，反应终止后，在450 nm波长处测定OD值。OD值与待测溶液中的FBs浓度呈反比。在此方法中，由于使用了MNPs，缩短的抗原抗体反应的时间，减少了检测时间。并在玉米中进行标准品添加回收实验，将实验结果与LC-MS/MS结果进行比较分析，评估该方法的准确性，旨在为玉米中FBs的快速筛查提供新的检测技术。

1 双探针检测方法原理

如图1B所示，MNPs-FB1探针作为捕获探针，用于和检测样品中的FB1竞争结合McAb。由于MNPs的分散特性和悬浮特性，与传统的间接竞争ELISA中的检测抗原相比，MNPs-FB1探针可悬浮于反应溶液中，缩短了与McAb的反应距离，加速MNPs-FB1-McAb反应平衡，从而缩短抗原抗体竞争反应时间。在本方法中（图1B），当有FB1存在时，MNPs-FB1探针和FB1竞争结合McAb-HRP探针上的McAb。当反应结束后，所形成的MNPs-FB1-McAb-HRP可通过磁性分离的方法与反应溶液分开，当撤去磁场后，MNPs-FB1-McAb-HRP又可重新悬浮于溶液中。复合物上的HRP作为催化剂催化TMB与H2O2间的显色反应，只需要一步竞争反应就可以完成整个检测过程，因此进一步缩短了检测时间，提升了检测速度。

2 MNPs-FB1探针鉴定

羧基修饰的磁性纳米颗粒与DCC和NHS反应，形成活化酯溶液，与FB1上的氨基反应，制备出MNPs-FB1探针。所合成的探针采用TEM进行形貌表征，从图2A可以看出，MNPs为球形，平均粒径为200 nm。当FB1成功连接到MNPs表面后，平均粒径由200 nm增加到220 nm（图2B）。从TEM可以看出（图2B），在MNPs表面上有细微的突起，说明FB1成功连接到MNPs表面。同时采用DLS测定MNPs和MNPs-FB1探针的水化粒径，如图3所示，MNPs和MNPs-FB1探针的平均粒径分别为200 nm和220 nm，与TEM所测得的粒径一致，进一步证明MNPs-FB1探针制备成功。将MNPs-FB1探针作为检测抗原，采用ic-ELISA方法对其稳定性进行测试，如图4所示，在4 ℃存放条件下，MNPs-FB1探针的OD值变化在5 个月内小于0.15，通过t检验发现，在5 个月内，各OD值之间无差异显著性，说明所制备的MNPs-FB1探针在4 ℃可稳定保存使用5 个月。

3 McAb-HRP探针鉴定

采用紫外分光光度法和直接ELISA法对所合成的McAb-HRP探针进行鉴定。如图5A所示，McAb的吸收峰在280 nm，HRP的两个吸收峰分别为275 nm和403 nm，McAb-HRP探针的吸收峰为290 nm。McAb-HRP探针的最大吸收波长与McAb和HRP不同，表明McAb-HRP探针合成成功。

同时采用直接ELISA方法对McAb-HRP探针的生物活性进行鉴定，从图5B可以看出，所合成的探针上的McAb对FB1具有较高抑制活性，说明合成探针的方法，没有降低McAb对FB1的亲和性和HRP的催化能力。

4 双探针检测方法优化

MNPs-FB1探针质量浓度与McAb-HRP探针稀释倍数的优化参照间接竞争ELISA的方法，采用棋盘法对其进行优化，当OD值在1.0左右时，所建立标准曲线的线性关系较好。从表1可以看出，当MNPs-FB1探针质量浓度为12.5 μg/mL，McAb-HRP探针稀释倍数为400 倍时，OD值为1.024，此时MNPs-FB1探针用量较少，McAb-HRP探针稀释倍数适中，确定为最佳实验条件。

根据P/N值确定最佳竞争反应时间和底物作用时间。从图6可以看出，当竞争反应时间为30 min时，P/N值最高，确定为最佳竞争反应时间，同理，最佳底物作用时间为8 min。

5 标准曲线建立

在最优实验条件下，以抑制率为纵坐标，FB1质量浓度对数为横坐标，采用四参数logstic曲线进行标准曲线拟合。如图7所示，所建立的双探针检测方法检测范围（IC15～IC85）为0.07～1.98 ng/mL，检出限（IC10）和IC50分别为0.04 ng/mL和0.29 ng/mL。本检测方法使用MNPs-FB1探针作为捕获探针，悬浮于反应溶液中，可加速抗原抗体之间的特异性反应，同时HRP连接在McAb上，无需再引入酶标二抗，减少了实验中的操作步骤，进一步缩短了反应时间，也减少了在实验过程中可能会出现的实验误差。所建立的检测方法与已发表文献相比，检测灵敏度更高（表2）。

6 方法特异性

FB1、FB2、FB3、玉米赤霉烯酮、T-2毒素、展青霉素、橘青霉素、脱氧雪腐镰刀菌烯醇8 种常见真菌毒素用于为检测该方法的特异性。由表3可知，所建立的检测方法与FB1、FB2、FB3交叉反应率较高，与玉米赤霉烯酮、T-2毒素、展青霉素、橘青霉素、脱氧雪腐镰刀菌烯醇交叉反应率低于1%。将FBs混合标准溶液由40 ng/mL梯度稀释至20 pg/mL，建立标准曲线（图8），检测范围（IC15～IC85）为0.10～9.86 ng/mL，IC50为0.78 ng/mL。以上结果表明，所建立的双探针检测方法可用于检测样品中的FBs总量。

7 精密性

通过板间和板内变异系数（coefficient of variation，CV）对双探针检测方法的精密性进行研究。将FBs混合标准溶液（FB1∶FB2∶FB3=12∶4∶1）稀释至终质量浓度分别为500、1000、1500 pg/mL。每个样品每天测定3 次，共测定3 d。如表4所示，板间CV和板内CV均低于3%，表明所建立的双探针检测方法的精密性较好。

8 双探针检测方法的应用

向阴性玉米粉中分别添加FB1、FB2、FB3和FBs混合标准溶液，使其终添加量分别为1、5、10 μg/kg，分别采用本方法和LC-MS/MS法进行检测，计算样品加标回收率。如表5所示，本方法和LC-MS/MS法的加标回收率范围分别为86.2%～105.1%和90.0%～107.8%，符合样品加标回收率要求，表明所建立的方法的重复性较好、准确度较高。

为进一步验证所建立方法的准确性，采用本方法和LC-MS/MS法同时对加标样品提取液进行测定。如图9所示，以双探针检测方法的测定值为横坐标，LC-MS/MS法测定值为纵坐标，拟合回归方程：y=0.99x－0.02，R2=0.9966，表明所建立的双探针检测方法可用于测定玉米样品中的FBs。

9 结论

合成了MNPs-FB1探针和McAb-HRP探针，并应用所制备的两种探针建立了快速、灵敏的伏马菌素双探针检测方法。所建立的检测方法，仅需38 min即可完成整个检测过程，建立的检测方法对FB1和FBs的检测范围分别为0.07～1.98 ng/mL和0.10～9.86 ng/mL。在玉米中的加标回收率范围分别为86.2%～105.1%，具有较好的重复性和准确性。所建立检测方法检测结果与LC-MS/MS法检测结果的线性回归方程为y=0.99x－0.02，R2=0.9966，该检测方法与LC-MS/MS法具有相同的检测能力，提高了检测速度，为玉米中FBs检测提供了有效的手段。