常用的色谱方法（吸附色谱、离子交换色谱和凝胶色谱）

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常用的色谱方法（吸附色谱、离子交换色谱和凝胶色谱）

2024-07-02 06:51| 来源: 网络整理| 查看: 265

常用的色谱方法（吸附色谱、离子交换色谱和凝胶色谱） 2010-04-28 23:38 · Edward

按色谱分离的机理来分，常用的色谱方法可分为吸附色谱、分配色谱、离子交换色谱、凝胶色谱和亲合色谱。一、吸附色谱(adsorption chromatography) 吸附色谱是指混合物随流动相通过由吸附剂组成的固定相时，由于吸附剂对不同组分有不同的吸附力，从而不同组分随流动相

按色谱分离的机理来分，常用的色谱方法可分为吸附色谱、分配色谱、离子交换色谱、凝胶色谱和亲合色谱。

一、吸附色谱(adsorption chromatography)

吸附色谱是指混合物随流动相通过由吸附剂组成的固定相时，由于吸附剂对不同组分有不同的吸附力，从而不同组分随流动相移动的速度不同，最终可将混合物中不同组分分离。这种分离方法取决于待分离物质被吸附剂固定相所吸附的能力，以及它们在分离时所用的溶剂流动相中的溶解度这两个方面的差异。根据操作方式不同，吸附色谱可分柱色谱和薄层色谱两种。

(一)柱色谱(Column chromatography)

在柱吸附色谱中，混合物的分离是在装有适当吸附剂的玻璃管柱中进行的，色谱柱下端铺垫棉花或玻璃棉，柱内充填溶剂湿润的吸附剂，待分离样品自柱顶部加入，样品完全进入吸附柱后，再用适当的溶液(洗脱液)洗脱。假如待分离的样品内含有A、B两种成分，在洗脱过程中随着流动相流经固定相，它们在柱内连续的分别产生溶解、吸附、再溶解的现象。由于洗脱液和吸附剂对A和B的溶解力与吸附力不同，A和B在柱内移动的速率也不同。溶解度大而吸附力小的物质走在前面，相反，溶解度小而吸附力大的物质走在后面。经过一段时间以后，A、B两种物质可在柱的不同区域各自形成环带。如A、B为有色物质，就可以明显看到不同的色层，每个色带就是一种纯物质。然后继续用洗脱液洗脱，分段收集，直到各组分按顺序先后完全从柱中洗出为止。

一般讲，非极性或极性不强的有机物如甘油三酯、胆固醇、磷脂等的分离，采用这种方法较为合适。

(二)薄层色谱(thin layer chromatography)

薄层色谱法是由德国学者E.S.Tahl于1958年改进的一种新色谱法，现广为应用。其方法是把吸附剂均匀地铺在一块玻璃板或塑料膜上形成薄层，待分离的样品点在薄层一端，在密闭容器中用适宜的溶剂(展开剂)展开，由于吸附剂对不同物质吸附力大小不同，因此当溶剂流过时，不同物质在吸附剂和溶剂之间发生连续不断地吸附、解吸附、再吸附、再解吸附，易被吸附的物质相对的移动较慢，较难吸附的物质则相对地移动得快一些。经过一段时间的展开，不同的物质就被彼此分开，最后形成互相分离的斑点。

薄层色谱的特点是：(1)灵敏度高，可检出微量物质。(2)分离能力强，斑点集中。(3)展开时间短。(4)操作简便。适用很多微量样品分离鉴定。

二、离子交换色谱(ion exchange chromatography)

离子交换色谱是以离子交换剂为固定相，利用其对需要分离的各种离子结合力的差异而将混合物中的不同离子进行分离的色谱技术。

离子交换剂是一类具有特殊网状立体结构的高分子多元酸或多元碱的聚合物，不溶于水和许多有机溶剂。聚合颗粒中带电荷的酸性或碱性基团作离子交换基团，通过静电作用与带相反电荷的离子(反离子)结合。当流动相中存在其带它相反电荷的离子时，就与先结合在固定相交换基团上的反离子进行交换。根据可交换离子的性质，离子交换剂分为阳离子交换剂和阴离子交换剂两大类。阳离子交换剂分子中具有酸性基团，能和流动相中的阳离子进行交换。例：

阴离子交换剂分子中具有碱性基团，能和流动相中的阴离子进行交换。如：

流动相中，不同离子化合物带电荷多少不同，与离子交换剂相互作用的强弱也不同，当它们被结合到固定相交换基团以上后，可以用提高流动相中的离子强度或改变pH的办法，把它们从离子交换柱上依次洗脱下来，达到分离纯化的目的。

常用的离子交换剂为人工合成的有机物，包括离子交换树脂、离子交换纤维素和离子交换葡聚糖等。根据交换基团酸碱性的强弱，阳离子交换剂又分为强酸型和弱酸型，阴离子交换剂又为强碱型和弱碱型。在实际工作中，可根据被分离物的性质选用适当类型的离子交换剂。如羟甲基纤维素(CM-纤维素)常用来分离中性或碱性蛋白质；二乙氨基乙基纤维素(DEAE-纤维素)常用来分离中性或酸性蛋白质；而离子交换树脂常用于分离小分子物质如氨基酸、核苷、核苷酸等及制备去离子水。

常用离子交换剂的类型见表2-1

表2-1 常用的离子交换剂的种类及解离基团

种类解离基团阳离子交换树脂强酸型

弱酸型磺酸基(—SO3H)等

羧基(-COOH)，酚羧基(-OH) 阴离子交换树脂强碱型弱碱型季胺盐—N+(CH3)3 叔胺—N(CH3)2，仲胺(-NHCH3)，伯胺(—NH2) 阳离子交换纤维素强酸型 (磺乙基纤维素) 弱酸型 (羧甲基纤维素) 磺乙基(—O—CH2—CH2—SO3H) 羧甲基(—O—CH2—COOH) 阴离子交换纤维素强碱型 (胍乙基纤维素) 弱碱型 (二乙氨基乙基纤维素) HN 胍乙基(—O—CH2—OH2—NH—C—NH2) 二乙基氨基乙基［O—CH2—CH2—NH(C2H5)2］阳离子交换交联葡聚糖强酸型 (磺乙基交联葡聚糖) 弱酸型 (羧甲基交联葡聚糖) 磺乙基（—O—CH2—CH2—SO3H）羧甲基（—O—CH2—COOH）阴离子交换交联葡聚糖强碱型 (胍乙基交联葡聚糖) 弱碱型 (二乙基氨基乙基交联葡聚糖) 胍乙基 HN （—O—CH2—OH2—NH—C—NH2）二乙基氨基乙基[O—CH2—CH2—NH（C2H5）2]

离子交换色谱通常采用柱色谱。柱色谱过程包括离子交换剂的选择，离子交换剂使用前的处理与变型、装柱、样品的准备与加样、洗脱、检测及离子交换剂的再生等若干步骤。这些步骤在生化技术有关参考书里都有详细记述，这里仅简要说明一下洗脱过程的有关原理。

经过离子交换被吸附在离子交换剂上的待分离物质，有两种洗脱方法：一是增加离子强度，使洗脱液中的离子能争夺交换剂的吸附部位，从而将待分离的物质置换下来；二是改变pH使样品离子的解离度降低，电荷减少，因而对交换剂的亲和力减弱而被洗脱下来，如低pH洗脱液容易使阴离子交换剂的样品洗脱。

从洗脱液的成分而言有两种类型，一是选用几种洗脱能力逐步增强的洗脱液相继洗脱，此为阶段洗脱法，适用于各组分对交换剂亲和力比较悬殊的样品；二是选用离子强度和pH呈连续梯度变动的洗脱液进行洗脱，使洗脱能力持续增强，此为梯度洗脱法，适用于各组分与交换剂亲和力相近的样品。

三、凝胶色谱(gel chromatography)

(一)原理

凝胶色谱是指混合物随流动相流经装有凝胶作固定相的色谱柱时，混合物中各种物质因分子大小不同而被分离的技术。凝胶，从广义上讲是指一类具有三维空间多孔网状结构物质，如琼脂糖凝胶、交联葡聚糖凝胶等。由于色谱过程与过滤相似，故又名凝胶过滤、凝胶渗透过滤或分子筛过滤；由于物质在分离过程中的阻滞减速现象，故亦称为阻滞扩散色谱或分子排阻色谱。

凝胶色谱的机理是分子筛效应，如同过筛那样，它可以把物质按分子大小不同进行分离，但这种“过筛”与普通的过筛不一样。凝胶色谱柱中装填的是许多直径小于一个毫米的凝胶颗粒，在凝胶颗粒内部又是由三维多孔网状结构构成。在洗脱过程中，当含有分子大小不一混合物样品加到凝胶床面后，大分子物质因其分子直径大于凝胶网孔而不能进入凝胶颗粒内部，只能沿着凝胶颗粒的空隙随溶剂流动，受到的阻滞作用小，流程短而移动速度快，先流出色谱柱；但分子量小的组分则由于其分子直径小于网状结构的孔径而进入凝胶颗粒内部，受到网孔的阻滞作用，流程长而移动速度慢，比大分子物质后流出色谱柱，从而使分子大小不同的混合物得到分离。图2-1可以形象地看到这个分离过程的实质。

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(二)凝胶

凝胶是由胶体溶液凝结而成的固体颗粒状物质，其内部都具有很微细的多孔网状结构。目前市场上供应的色谱用凝胶主要有交联葡凝聚糖、交联聚丙稀酰胺以及琼脂糖等。

交联葡聚糖，瑞典出品商品名称为Sephadex，国产商品名称为Dextran，它是由葡聚糖(右旋糖苷)和甘油通过醚桥(—O—CH2—CHOH—CH2—O—)相交联而成的多孔性网状结构，制备葡聚糖凝胶所用的交联剂为3氯-1.2—环氧丙烷()由于交联度的不同，

Sephadex颗粒孔隙大小也不同，按交联程度大小，Sephadex可以分成不同的型号，交联度大的孔隙小吸水少，膨胀也少，用于小分子量物质的分离，交联度小的孔隙大吸水多，膨胀也大，适用于大分子物质的分离。交联度可用“吸水量”表示，即每克干凝胶所吸收的水份重量，用这个量比较交联度的大小。商品凝胶的型号采用“吸水量”(水容值)的10倍数字来表示。例如每克凝胶吸水量为2.5克即定为G—25型，见表2-2。

表2—2葡聚糖凝胶（G）类的技术数据

型号分离范围（分子量）吸水量

克/克干凝胶膨胀体积毫升/克干凝胶浸泡时间（小时）蛋白质多糖 20~25℃ 90~100℃ G—10 &700 &700 1.0±0.1 2~3 3 1 G—15 &1500 &1500 1.5±0.2 2.5~3.5 3 1 G—25 1000~5000 100~5000 2.5±0.2 4~6 3 1 G—50 1500~30000 500~10000 5.0±0.3 9~11 3 1 G—75 3000~70000 1000~50000 7.5±0.5 12~15 24 3 G—100 4000~150,000 1000~100,000 10±1.0 15~20 72 5 G—150 5000~400,000 1,000~150,000 15±1.5 20~30 72 5 G—200 5000~800,000 1000~200,000 20±2.0 30~40 72 5

(三)凝胶色谱的特点及其应用：

凝胶色谱与其它色谱比较具有以下特点：(1)由于凝胶色谱是按分子大小不同而分离，洗脱剂种类不影响洗脱效果，所以可以保证在温和条件下洗脱，不会引起生物物质的变性失活；(2)凝胶色谱中无需改变洗脱液成分或种类。一次装柱后凝胶可反复使用，而且每次洗脱过程即是凝胶的再生过程。(3)实验具有高度的重复性，回收样本几乎可达100%，既可用于大样本制备，亦可用于小样品的分析。所以应用广泛。

凝胶色谱法的应用：

(1)作为分析工具：

分子量相差比较大的混合物可以用凝胶色谱进行分析。在凝胶色谱的基础上配合使用纸色谱或薄层色谱法可以鉴别出各个析离成分。

(2)作为脱盐工具：

高分子(如蛋白质核酸、多糖等)溶液中的盐类杂质可以借助凝胶色谱法将其除去，这一操作称为脱盐，凝胶色谱法脱盐速度快而完全，而且蛋白质、酶类等成分在分离过程不易变性。

葡聚糖凝胶SephadexG-25因流动阻力小交联度适宜，常用于蛋白质溶液的脱盐。

进行蛋白质样品的脱盐，应注意蛋白质溶液在去除电解质后，因溶解度显著下降以致成为沉淀物析出，从而被吸附在柱上不能洗脱下来。解决办法是，先使用有挥发性盐类如甲酸铵、醋酸铵等缓冲液洗脱，取得洗脱液后再用冷冻干燥法除去挥发性盐类。

(3)高分子溶液的浓缩：

干燥的葡聚胶颗粒内部有总值等于Vi的孔隙容积。当把干燥的凝胶颗粒投入稀的高分子溶液时，水分和低分子物质就会进入凝胶粒子内部的孔隙直到充满为止，而高分子物质则排阻于凝胶颗粒之外，因此经几十分钟后，通过离心或过滤，就可以分离出膨胀的凝胶颗粒得到浓缩了的高分子溶液，其中离子强度和pH直都保持不变。这种浓缩方法特别适用于不稳定的生物高分子溶液的浓缩。

(4)用于去除热原物质：

热原物质是微生物产生的某些使人发热的物质，如某些多糖蛋白质复合物等，用凝胶处理去离子水，可以得到适于制备注射剂的无热原水。

(5)用于测定高分子物质的分子量

用一系列已知分子量的标准样品放入同一凝胶色谱柱内，令其在同一条件下进行凝胶色谱分离，记下每一种成分的洗脱体积，并以洗脱体积对分子量的对数作图，在一定分子量范围内，可得一直线这就是分子量的标准曲线。

测定未知物的分子量时，可将此样品加在测定标准曲线的凝胶柱内，洗脱后，根据此物的洗脱体积可在标准曲线上查出它的分子量。用这种方法测定高分子量时，不需要复杂的仪器设备，操作简便，样品用量少，有一定的实用价值。

(6)用于物质的分离提纯

凝胶色谱法已广泛应用于酶、蛋白质、氨基酸、核酸、核苷酸、多糖、激素、抗菌素、生物碱等物质的分离提纯，尤其在和其他技术配合应用效果更为显著。

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