LNP的设计原理和制剂生产的关键因素

脂质组分与核酸之间的比率报告为N:P比，用来表示阳离子脂质中的阳离子叔胺与来自核酸的阴离子磷酸基团之间的电荷平衡。这一性质是电离阳离子脂质与寡核苷酸络合的基础。LNP的N:P比率通常在6左右。

LNP的稳定性较差，因此更难制造接近1:1的CIL:核苷酸比例，这与强相互作用的带相反电荷的两亲体/聚电解质系统的典型行为非常吻合。这些混合物接近电荷中性，表现出宏观分离，因此，较高的N/P比似乎更有利于放大生产性。另一方面，高负载的CIL可能会带来不良反应的风险，因此，需要通过工艺优化来平衡N/P比率。

重量比及N:P比值在针对不同核酸类型药物的包封时也略有不同。例如，siRNA的尺寸较小，相较于mRNA会暴露更大的碱基表面积与辅助脂质相互作用。Peter Cullis团队发现，以相同比例配置的LNP-mRNA由于相对较大的核酸尺寸，使得其无法像等比例LNP-siRNA那样具有更多与辅助脂质作用的表面积，导致DSPC分离并形成双层水性囊泡结构。

因此，需要根据包封内容物的不同对脂质组成和比例进行相应调整，以达到相同的LNP结构和功效。

图1. 双层水性囊泡结构

脂酸解离常数(pKa)

可电离阳离子脂质的酸解离常数（pKa）决定了LNP的电离行为和表面电荷，并进一步影响LNP的稳定性和毒性。

传统的永久电荷阳离子脂质如DOTAP（溴化三甲基-2, 3-二油酰氧基丙基铵）在早前用于核酸递送的研究中，极易与体内带负电荷的血清蛋白发生凝聚，将导致LNP被单核吞噬细胞系统快速清除，严重缩短了LNP的体内半衰期。且该凝聚作用增加了毒副作用的风险，导致红细胞膜破损和溶血。

内体释放通常是核酸成功递送和体内活性的限速步骤。全身给药后，ICLs应当能根据环境的pH值调节其电荷，例如血液（pH 7.4）和内吞细胞器（pH 5.5-6.5），以确保适当的载体形成、最佳的血液循环和有效的核酸释放到细胞质中。这种灵活性取决于掺入脂质的电离特性。由此，pKa值为6.0~7.0的可电离阳离子脂质应运而生。可电离脂质LNP（iLNP）确保了核酸在酸性条件下包封(pH 4.0，脂质被质子化)，并降低了体内循环过程中的毒性(pH 7.4，脂质变为中性)。

理想情况下，在酸性pH值（即内体环境）下，ICL的头部应再次带正电，以促进与暴露在内体膜上的带负电荷的脂质结合。这种相互作用使得脂质载体形成倒六边形（Inverted hexagonal）结构，进一步促进原内体膜的破坏，将治疗性核酸递送到细胞质中。例如，研究发现，LNP的pKa值在6.2-6.5和6.6-6.9时分别利于体内肝递送siRNA和肌肉注射mRNA疫苗。

理化特性

LNP的理化特性，包括尺寸、表面电荷（zeta电位）和表面修饰，对LNP的功效、药代动力学和生物分布有直接影响

LNP尺寸对整体药物的靶向性和循环寿命至关重要。研究表明，更小的颗粒更容易逃避单核吞噬细胞机制的清除，通常有更长的循环半衰期。此外，小于100nm的颗粒可轻易通过有孔的内皮细胞穿透靶组织。除配方变化导致的粒径大小不同，还可通过不同的LNP制备方法，如可以使用挤压来实现更小、更均匀的颗粒尺寸。

Genevant公司的研究团队在非人灵长类模型中探究了不同LNP粒径尺寸对转染效率的影响。研究发现，非人灵长类动物具有比小鼠更小的肝窗。该生理特征的不同提示，通过将LNP粒径减小到~50-60nm时或能更好地在人体内递送药物到达肝脏细胞提高转染效率。

表面电荷（zeta电位）主要影响LNP的循环清除。研究发现，高表面电荷，无论是正（+30 mV）还是负电荷（-30 mV），通常会导致更快的血液清除和快速的RES 捕获，而中性电荷的LNP（从-10到+10 mV）促进延长血液循环并减少RES摄取。此外，由于与带负电的细胞膜相互作用，带正电荷的LNPs表现出比中性或带负电荷的LNPs更高的内化效率，导致毒性增加。出于这个原因，目前临床治疗主要使用在血液环境下具有近中性 zeta电位的LNP。zeta电位可以通过改变N:P来调节。

LNPs的工业生产

在研究阶段用于制备LNP的过程与用于临床和商业生产的工艺之间存在重大差异，这最终会影响其性能。为了确保在制造过程中保持产品的关键质量属性，控制工艺参数并确定相应的质量标准非常重要。

微流控混合平台在过去几年中越来越受欢迎，主要由于四个重要方面：

（1）流速和混合条件的高度可控性，可以制备均匀的（单分散）LNPs，减少批次间差异;

（2）便于工业水平的生产放大和提高生产率的能力;

（3）实时监测微通道内发生的生产情况;

（4）具有定制微通道几何形状和结构的微流体装置，用于增强LNPs的载药量和复合物稳定性。

T型或Y型混合器

T型或Y型混合器是微流控装置最早和最基本的设计之一。在T型液混合方法中，含有核酸的水相溶液与含有脂质有机溶剂的乙醇溶液在T型连接器中使用双泵系统混合（图2）。由于混合方法快速，脂质分子过饱和，允许LNP自组装成所需的结构，而无需考虑额外减小尺寸的方法。最后经过滤可以进一步稳定颗粒。尽管与传统方法相比，该方法表现出许多优点，但仍存在一些挑战。

流体动力流聚焦混合（Hydrodynamic flow focusing）

实现不同类型LNP连续生产的最广泛方法之一是流体动力流聚焦混合。在这种方法中，含有脂质的有机溶液通过中央入口通道，而核酸水相溶液从两个侧入口通道注入。这两种流的混合物发生在一个小区域内，这允许在受控的层流条件下产生液滴。

与传统T型或Y型微流控通道类似，该方法也可以通过修改中央通道的直径和微通道设计以调整混合时间。

交错人字形和环形混合器

通过利用连接到微流控装置的交错人字形结构，可以进一步改进制备过程。开发这种方法是为了改善对混合过程的控制并减少混合时间。有机溶液中的脂质和水溶液中的核酸被泵入两个单独的入口。然后，交错的人字形结构引起剧烈的混合层流，由于流体之间接触面积呈指数级增长，使得两种溶液能快速有效地混合（图2）。然而，对于商业规模目的，人字形设计具有局限性，因为很难达到良好生产规范（GMP）所需的高通量速度（流速容量）。

为了克服这些问题，Precision NanoSystems开发了环形混频器架构（图2）。环形设计允许通过增加涡流和离心力的数量来改善混沌平流的混合。目前，经典的NanoAssemblr Benchtop®被NanoAssemblr NexGen Ignite®和NanoAssemblr NexGen Blaze® 取代。

图2. 代表性微流控装置的原理图示

LNPs的稳定性和储存

稳定性研究对于帮助确定最终产品的保质期和最佳储存条件至关重要。LNP-核酸制剂的稳定性取决于温度、湿度和光照等加工参数，以及核酸和脂质赋形剂的性质。

众所周知，市售的mRNA LNP疫苗由于在2-8°C的溶液中缺乏长期稳定性而被冷冻。冷藏条件下的保质期有限主要归因于mRNA的化学降解以及溶液中核苷酸和脂质杂质的再反应特性。

提高LNP-RNA稳定性的方法包括配方策略，例如添加缓冲液、表面活性剂和其他赋形剂，使用有效的过程控制，以及使用适当的冷冻保护剂（蔗糖、海藻糖或甘露醇）冷冻或冻干。尽管已知该过程会影响LNP的大小和封装，但这些属性不是影响LNP性能的唯一决定因素。

溶液中赋形剂（例如缓冲液和糖）的选择对于该方法至关重要，这表明溶液培养基对复溶时LNP的形成和胶体稳定性有很大影响。LNP的胶体稳定性将受到其脂质组成的影响，这表明有效的脂质混合以及与RNA载物的相互作用对于获得更稳定的产品是必要的。

此外，使用中的稳定性研究对于确保疫苗在运输和临床应用过程中保持稳定至关重要。在生产、储存、运输、配送和使用期间，温度变化是不可避免的。为了促进疫苗接种率的提高，监管也同样鼓励根据足够的数据（例如热循环稳定性数据）开发额外的储存条件。

LNP的主要成分及原理

可电离阳离子脂质（ICLs）

可电离阳离子脂质是LNP配方中的关键成分，具有带正电荷的亲水胺基头与长亲脂尾相连的两亲性结构。

可电离阳离子脂质结构可分为三部分：胺基头部基团（Headgroups）、疏水性尾部基团（Tails）和内部连接片段（Linkers）。

图3.可电离阳离子脂质结构

根据头部基团的胺基数量，阳离子脂质又可以分为单胺基或多胺基脂质。最著名的DLin-MC3-DMA(MC3)、SM-102和ALC-0315均是单胺基脂质，也是FDA批准的唯三可用于RNA递送的可电离阳离子脂质。然而这三种可电离阳离子脂质都不可经生物降解，在体内蓄积将产生潜在的细胞毒性。

研究人员通常专注于脂质尾部结构的调整，通过改变尾巴数量、设计线性或分支结构以及引入不饱和或可生物降解键来增强效力或赋予特定功能。例如，MC3的不饱和尾部促进了siRNA的内涵体逃逸，L319的酯键可加速细胞内脂质的降解。

表2. 代表性的linker结构

磷脂

磷脂是帮助脂质纳米颗粒自组装和内涵体逃逸的辅助脂质。在临床前研究和临床应用中，常用的磷脂是DSPC和DOPE。

DOPE是一种具有两条不饱和链（C18）的磷酸乙醇胺。由于其不饱和特性，DOPE具有梭原特征，因此通过促进非双层倒六边形结构来促进LNP与内体膜的融合。相比之下，DSPC是一种饱和的两亲性脂质。它具有中性总电荷，由季胺和带负电荷的磷酸基团组成，连接两条饱和链（C18）。由于饱和特性，DPSC具有圆柱形，因此不表现出膜不稳定特性，而是倾向于形成稳定的双层结构。Moderna和BioNTech/Pfizer已上市的两款mRNA新冠疫苗均采用了DPSC。

程强与魏妥研究员早前与Daniel Siegwart等人开发了一类可电离辅助脂质iPhos，其含有两性离子头部和三个烷基尾部的独特结构更容易引起内体膜融合并促进载物释放，性能显著优于DSPC与DOPE。

另有研究表明，磷酸乙醇胺(PE)头基对增强LNPs的膜融合和内体逃逸具有重要意义，且带有极性的磷脂可以改变载体器官靶向性。

胆固醇

胆固醇有助于增加LNPs的稳定性，并帮助细胞膜融合，优化胆固醇的结构也可以提高LNPs的递送效率并赋予LNPs特定的功能。

有研究在天然胆固醇类似物中筛选了显著提高转染效率的β-谷甾醇LNP(eLNP)，他们通过分析该胆固醇类似物的SAR，发现eLNP具有多面体结构形态并由不同的表面脂质组成，这可能有助于内涵体逃逸和mRNA释放。

PEG脂质

聚乙二醇化(PEG)脂质主要作用于减少纳米颗粒聚集，减少单核吞噬细胞吞噬，延长系统循环时间。然而PEG脂质也会阻碍于靶细胞的相互作用和内涵体逃逸，降低转染效率。通过优化聚乙二醇化化学和LNP表面PEG的密度，可以改变LNPs的药代动力学和药效学。

研究数据表明，PEG脂质碳链越短，解吸速度就越快，二烷基链的长度和聚乙二醇化脂质浓度/分子量显著影响LNPs在体内的药代动力学、药效学和生物分布。然而，过短（5kDa）或高摩尔比的PEG（>15mol%）会导致膜通透性降低，从而严重降低细胞摄取。因此，通常采用具有中等分子量（∼2 kDa）的PEG分子以