Mannose Receptor (MRC1)靶点介绍及实验小贴士

2024-07-12 08:31| 来源: 网络整理| 查看: 265

图一：Mannose Receptor蛋白结构。图片来源：SWISS-MODEL。Mannose Receptor靶点介绍蛋白功能蛋白表达蛋白定位异构体 & 翻译后修饰WB实验贴士注意事项阳性对照阴性对照结果示例关键控制点

IHC实验贴士注意事项阳性对照结果示例关键控制点参考文献

Mannose Receptor靶点介绍蛋白功能

Mannose Receptor即甘露糖受体（又名CD206），是一种高度糖基化的I型跨膜蛋白，主要存在于巨噬细胞，树突细胞和无血管内皮细胞的表面。

Mannose Receptor能够介导可溶性和颗粒状碳水化合物结构的内在化，从而参与先天免疫。

Mannose Receptor通过巨噬细胞介导糖蛋白的内吞作用，可以结合硫酸化和非硫酸化的多糖链。

Mannose Receptor充当细菌、真菌和其他病原体的吞噬受体或登革热病毒包膜蛋白E的受体。

蛋白表达

高表达于肺和淋巴组织中

蛋白定位

Mannose Receptor蛋白定位于细胞膜和内体膜

图二：Mannose Receptor ICC实验结果图, Anti-Mannose Receptor antibody [EPR25215-277] (ab300621)。

Untreated: Raw 264.7。Treated: IL-4 (40 ng/ml)处理Raw 264.7 细胞 4 天, 然后 IL-10 (40 ng/ml) 再处理 4天。

绿色：Mannose Receptor，红色：alpha Tubulin，蓝色：DAPI。

异构体 & 翻译后修饰

人（P22897）：异构体1：166kD（预测）异构体2：57kD（预测）

小鼠（Q61830）：165kD（预测）

大鼠（D3ZD31）：165kD（预测）

Mannose Receptor存在二硫键及糖基化修饰。

WB实验贴士注意事项 Mannose Receptor（CD206）主要在巨噬细胞和树突状细胞表达，也可在淋巴、肝和脾内皮、肾系膜细胞、气管平滑肌细胞和视网膜色素上皮中表达。建议选择表达量较高的样本作为阳性对照，例如肺。 Mannose Receptor（CD206）是一种预测约166 kDa的膜结合蛋白，煮样可能会引起蛋白聚集，若无信号，建议样本制备后不煮样。 Mannose Receptor在大脑中的表达在生命的第一周达到最高，此后急剧下降，在整个成年期保持在低水平。因此在正常全脑裂解液中，很难检测到信号。 Mannose Receptor还有存在可溶性的形式，可溶性CD206存在于人树突状细胞、人巨噬细胞和小鼠巨噬细胞的培养基中，也存在于人和小鼠血清中。研究发现，CD206的可溶形式分子量比膜结合形式更小。 Mannose Receptor还存在翻译后修饰，例如糖基化修饰，因此实际检测分子量可能比预测分子量大。在炎症反应过程中，IL-4和IL-13会刺激Mannose Receptor（CD206）表达会上调。对于部分细胞如RAW264.7，IL-4和IL-10处理会增加CD206的表达，因此刺激处理有利于解决WB实验时无信号或信号弱等问题。(可参考阳性对照) 阳性对照肺组织裂解液。阴性对照（无表达或弱表达）  小鼠：脑组织裂解液，RAW 264.7全细胞裂解液  大鼠：脑组织裂解液结果示例

图三：WB-Anti-Mannose Receptor antibody [EPR25215-277] (ab300621)

泳道1：小鼠肺组织裂解液泳道2：小鼠肝脏组织裂解液泳道3：小鼠脑组织裂解液泳道4：Raw264.7全细胞裂解液泳道5：20ng/ml IL-4 和 10uM Dexamethasone处理18小时的Raw264.7全细胞裂解液泳道6：大鼠肺组织裂解液泳道7：大鼠肝脏组织裂解液泳道8：大鼠脑组织裂解液

上样量：20 µg/泳道 预测条带大小：166 kDa 观察条带大小：200 kDa 曝光时间：3分钟封闭液和抗体稀释液：5%脱脂奶粉

关键控制点 

在实验中除了需要注意常规问题外，还要特别关注以下关键控制点：

样本制备：添加足够量的蛋白酶抑制剂以避免靶标蛋白降解。整个样本制备过程中，保持样本置于冰上。通过Bradford分析、Lowry分析或BCA分析测定样本总蛋白浓度。若煮样后无信号或信号弱，强烈推荐不要煮样，防止蛋白聚集。电泳：使用新鲜制备的裂解液。至少上样20μg总蛋白进行电泳。分子量大的靶标蛋白 (分子量 >100 kDa)，推荐使用8% 分离胶。转膜：在转膜缓冲液中添加终浓度为0.1%的SDS。充分冲洗PVDF 膜，确保膜上残留甲醇全部去除。建议转膜缓冲液中甲醇浓度为10%。强烈建议转膜完成后使用丽春红染色，确定转膜是否成功。

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