【求助】PCR双酶切讨论

2024-02-25 11:02| 来源: 网络整理| 查看: 265

如果是PCR产物进行双酶切，有哪些因素会影响酶切效果？有没有什么方法判断是否酶切开了？我进行克隆时，总是出现假阳性，或者就干脆平板上长一颗两颗或没有，挑出来有质粒但是双酶切鉴定时没有目的片段。郁闷！后用20小时对PCR产物进行双酶切，结果却克隆出来了，然而，再以同样的方法做另外的克隆时却没有做出来！请求指教，谢谢！没有人回答这个问题难道无法解决吗?PCR产物酶切好象没办法判断吧，因为酶切下来的只有一点东西。要想酶切好，就先对PCR产物进行纯化，把PCR反应体系的东西去掉。然后酶切体系不要太小，20-30ul是需要的。胶回收时，电泳速度要慢，时间要长。大概就可以了。PCR产物酶切前后都已经过了纯化，酶切体系也没有问题。但是只有克隆完成后才可以知道是否酶切完全，而且克隆成功与否是与许多因素相干的，也就是说目前为止没有什么方法可以确保PCR酶切是否已经切开喽。如jessicachen所说，先进行纯化然后酶切，另外酶切的时间要比质粒酶切长一些，可以过夜切，然后对酶切体系进行酶灭活就可以了。PCR产物酶切电泳是不好判断。

但楼主可以先将PCR产物与T载体连接，转化。然后鉴定看有没有与T载体连接上。如果连接上了的话，就可以抽提这个重组质粒，然后酶切，会出现两条带。跟你目的片断一样大的那条带就是你要的目的片断，这样就可以直接拿去连接了，呵呵

谢谢各位的回复和建议！但是有个问题：PCR如果用高保真的PFU酶的话，是无法加上POLY（A）尾的，如果用TAQ酶的话，变异的可能性比较大，会影响到后续的表达分析，因此用T载体是否适合？个人觉得有几点需要注意: 1. PCR产物进行双酶切,说明你在PCR引物中加入了酶切位点,所以酶切位点后的保护碱基是否恰当,比如保护碱基数目等.因为不同酶切位点后面需要加入的保护碱基是不同的,这直接影响酶切效率.2. 你的PCR产物进行了纯化,那你在纯化过程中是否有乙醇残留(如果是试剂盒的话漂洗液中一般也含有乙醇),如果纯化过程乙醇没有除尽,那直接会影响你后续的酶促反应,肯定影响切割效率3. 用 Pfu酶扩增后的产物可通过加A反应使其末端加A,这样就可以进行T-A克隆了最后祝你好运!TO 游来游去：用KIT纯化PCR产物最后一步是用水溶，而且我经过了3遍的水洗，我想应该不会有乙醇残留了吧。另外，我想请教：1，PFU扩增后怎么加A尾？效果如何？2，引物设计具体操作步骤是什么样的？（因为我从来没有自己设计过引物，还只是菜鸟呵呵。）谢谢！加A体系：加入回收的PCR产物1~7微升，Taq酶buffer 1微升Taq酶1微升dATP至终浓度0.2mM补水至10微升

放入pcr仪，70度，30min就可以了。这个反应是利用Taq酶的末端转移酶活性，因为不是Taq酶的主要活性，所以酶量要比pcr反应来的高得多。至于Taq酶，我试过1块钱20微升的烂酶，都毫无问题。祝你成功。

TO griffin_zhou：谢谢你的指教！受用。另外，我还是请求哪位高人帮忙解答一下：引物设计具体操作步骤是什么样的？（因为我从来没有自己设计过引物，还只是菜鸟呵呵。）谢谢！liaoli1115 wrote:另外，我还是请求哪位高人帮忙解答一下：引物设计具体操作步骤是什么样的？（因为我从来没有自己设计过引物，还只是菜鸟呵呵。）谢谢！

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liaoli1115 wrote:如果是PCR产物进行双酶切，有没有什么方法判断是否酶切开了？

我觉得如果不想通过上面有人说的连接T载体再酶切的话，可以像以下这样做来验证双酶切是否成功，我也是这么做的：1）确保PCR产物的酶切位点有保护碱基2）拿具有同样两个酶切位点的空质粒载体做试验，设三管，一种酶一管，第三管双酶切，三管缓冲体系一样。如果三管都能得到线性载体的话，说明这个双酶切应该是没问题的。（当然这需要另外提取这种验证载体，我常常备有这样的载体，所以做起来方便）

TO BOCON：TO BOCON：我没有明白你这样做是为了验证质粒载体是否双酶切开，还是PCR产物是否双酶切开？好象你是在验证质粒载体是否双酶切开吧？但我想知道的是PCR产物是否双酶切完全。这对后面的连接以及克隆成功与否非常关键。我曾经花了半年的时间想将PCR的片段双酶切后与质粒连接都无果，后将PCR 连到T 载体后再连载体，很快就连上了，期间我还摸过时间梯度，为了保证酶切完全，可是还是无果，连上后测序突变了三次，后用PFU酶扩后，100ul的体系结束后直接加了0.3UL的EX TAQ 酶，72度10分钟加A尾，再回收后T 连接，筛到阳性后测序，结果很好，建议可以试试我的这个笨方法啊～哦谢谢你提供的方法和思路。我用50微升的双酶切体系对PCR产物酶切时，摸索时间由原来的4小时切到20小时，结果20小时的酶切后，有时能做出来有时却做不出来，而以同样的方法再重复一遍时却有的又可以做出来，真的好象抽奖一样，是概率问题。似乎一点也不稳定，全靠运气。To chenjun2005:你的方法很好啊！这样在加A尾的过程中是否就不需要再额外加dATP了呢？1、PCR产物酶切效率肯定比T连后的酶切效率低。主要是酶的位点识别问题，DNA的二级结构使处于两端的酶切位点序列处于隐蔽状态。2、酶切产物最好用10Xloading buffer上样跑胶，不要用6Xloading buffer,以避免内切酶占位，影响连接。3、T载体是克隆试验中很好的工具，利用的好能节约很多事。4、probest酶的保真性好，但效率不理想，而且因为具有外切酶活性，产物T连前要加A,其实LA taq酶保真性也不错，但效率不是probest酶可比的。呵呵，还需要多多学习。我也正在学习rt-pcr，我做的克隆都是双酶切连接的，其实也不难。

可能有几点注意：

1. 注意添加保护碱基，可以参照NEB手册，不要图省钱，还是按里面需要的碱基数加上；

2. 纯化：我都是柱纯化（或玻璃奶）的，效果也很好，不一定非得切胶，节省时间，而且保护自己（呵呵，切胶很烦）；

3. 双酶切：要加入足量的酶，我一般是加入等量的两种酶，总体积不超1/10，主要是防止甘油>5％，同时酶又是足量的，1－3小时足矣；

4. 还是柱纯化，呵呵；

5. 连接：注意按分子克隆的操作步骤做，尤其是先45度水浴，置冰上，再连接。同时做好对照，可以了解双酶切和连接的效果，如：(1) plasmid(2) plasmid + ligase(3) pcr + plasmid + ligase等

To:smartkevin"45度水浴，置冰上，再连接"为什么 ,有什么好处?

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