两大方法帮你搞定质粒构建

（2）反向引物：5’ 端-保护碱基序列+限制性内切酶 2 酶切位点序列+基因反向引物序列 -3 ’端

如果目的基因片段较长的话，可以选择 PCR 方式扩增目的基因片段

[可选 PCR 扩增体系]

ddH2O：14ul

10xTaq buffer：2ul

10um DNTP：1ul

10um primer F：0.5ul

10um primer R：0.5ul

模板 DNA：1ul

Taq 酶：1ul

[可选 PCR 扩增条件]

(1)95℃：5min

(2) 35cycle

95℃：30s

55℃：30s（退火温度可以根据目的引物TM值决定，一般退火温度根 据引物TM值降低5度）

72℃：40s

(3)72℃：10min

(4)16℃：hold

引物扩增之后，首先要进行琼脂糖凝胶电泳验证条带大小，然后通过胶回收，获得纯化目的片段产物.由于加入保护碱基，回收产物需要进行双酶切，双酶切方法与质粒酶切方法相同。

3. 载体与目的基因的连接，推荐在 10~20μl 反应体系中进行接反应。

[可选连接体系]

载体 25 ng

退火产物 2 ul

10 x T4 buffer1 ul

T4 DNA ligase 1 ul

T4 连接酶一般选择 4 度过夜

4. 转化

将连接产物转化到受体菌中（一般为 DH5a），涂板，培养过夜。

5. 挑取单克隆，并鉴定

挑去平板上的单克隆培养，可以通过 PCR 或者酶切初步鉴定阳性克隆，对初步鉴定出来的阳性克隆进行测序。

贰

下面开始重点介绍重组酶构建质粒，基于同源基因重组原理，适用于向几乎任何载体在任何位点进行定向克隆，无需考虑插入片段自身携带的酶切位点可高效克隆 50 bp～10 kb 片段，同时构建时间也大大缩短。

1. 载体的制备一般推荐双酶切线性化，线性化完全，假阳性克隆低。酶切体系同上。

2. 对于使用重组方式连接来说，PCR 要设计引物, 设计引物时要根据质粒载体和基因序列选择合适的同源序列，通过 PCR扩增方式进行连接，PCR 的产物要纯化。

引物设计原则简单总结一下：

（1）前向引物：5’ 端--上游克隆载体末端同源序列+基因正向扩增引物--3’ 端

（2）反向引物：3’ 端--基因反向扩增引物+下游克隆载体末端同源序列--5’ 端

如果设计的基因特异插入片段扩增产物长度较长，可以选择 PCR 方式进行目的引物的扩增。

[可选PCR 扩增体系]

ddH2O 14 ul

10 x Taq buffer 2 ul

10 um DNTP 1 ul

10 um primer F0.5 ul

10 um primer R 0.5 ul

Vector 1 ul

Taq 酶 1 ul

[可选PCR 扩增条件]

(1)95℃：5min

(2) 35cycle

95℃：30s

55℃：30s（退火温度可以根据目的引物TM值决定，一般退火温度根 据引物TM值降低5度）

72℃：40s

(3)72℃：10min

(4)16℃：hold

PCR 扩增后，通过胶回收方式获得纯化的 PCR 产物。纯化后的 PCR 产物不需要进行酶切，直接用于重组反应。

3. 目的引物与线性载体进行重组反应。

[可选重组体系]

5 × CE II Buffer 4 μl

线性化克隆载体 50～200 ng

插入片段扩增产物20～200 ng

Exnase®II 2 μl

ddH2O x ul

在冰水浴中配制，配制完成后，用移液器上下轻轻吹打几次混匀各组分，置于 37 ℃ 反应 30 min。待反应完成后，立即将反应管置于冰水浴中冷却 5 min。重组效率在反应 30 min 左右达到最高，反应时间不足或者太长都将会降低克隆效率，这样大大减少了连接时间。

4. 转化

将连接产物转化到受体菌中（一般为 DH5a），涂板，培养过夜。

5. 挑取单克隆，并鉴定

挑去平板上的单克隆培养，可以通过 PCR 或者酶切初步鉴定阳性克隆，对初步鉴定出来的阳性克隆进行测序。

最后，几个主要注意事项：

1. 载体克隆位点选择尽量选择无重复序列，且 GC 含量比较均匀的区域进行克隆。当克隆位点上下游 20 bp 区域内 GC 含量均在 40%～60% 范围之内时， 克隆效率将达到最大.

2. 最适克隆载体与插入片段摩尔比为 1:2，即最适插入片段使用量为 0.06 pmol。这些摩尔数对应的 DNA 质量可由以下公式粗略计算获得：

最适克隆载体使用量 = [0.02 × 克隆载体碱基对数] ng（0.03 pmol）

最适插入片段使用量 = [0.04 × 插入片段碱基对数] ng（0.06 pmol）

3. 双酶切 1 和 2，在设置酶切体系时要考虑酶切温度以及 Activity in NEBbuffer 的问题，可在 NEB 公司主页的 Double Digest Finder 里面进行查询。

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