双缩脲法蛋白质含量测定

实验17 蛋白质含量测定（双缩脲法）

一、目的

掌握双缩脲法测定蛋白质含量的原理和方法。掌握分光光度计的使用方法。

二、原理

碱性溶液中双缩脲（ NH 2 一 co 一 NH 一 co 一 NH 2 ）能与 Cu 2 + 产生紫红色的络合物，这一反应称为“双缩脲反应”。蛋白质分子中的肽键也能与铜离子发生双缩脲反应，溶液紫红色的深浅与蛋白质含量在一定范围内符合朗伯一比尔定律，而与蛋白质的氨基酸组成及分子质量无关。其可测定范围为 1- l0mg 蛋白质，适用于精度要求不高的蛋白质含量测定。 Tris ，一些氨基酸， EDTA 等会干扰该测定。

三、仪器、试剂和材料

1 ．仪器

（ 1) 分光光度计  （ 2 ）分析天平  （ 3 ）振荡机  （ 4 ）刻度吸管： 1m1X2 ， 5m1X2 ， 10m1 X 1

(5 ）具塞三角瓶： 1OOml  （ 6 ）漏斗： 13 个

2 ．试剂

（ 1 ）双缩脲试剂：取硫酸铜（ Cu S0 4 5H 2 O ） 1.5g 和酒石酸钾钠（ NaKC 4 H 4 O 6 .4H 2 O ） 6.0g ，溶于 500m1 蒸馏水中，在搅拌的同时加入 300m1 10% NaOH 溶液，定容至 1000 ml ，贮于涂石蜡的试剂瓶中。

（ 2 ） 0.05mol/L 的 NaOH 。

(3) 标准酪蛋自溶液：准确称取酪蛋白 0.5g 溶于 0.05mol/ L 的 NaOH 溶液中，并定容至 100m1, 即为 5mg/m1 的标准溶液。

3 ．材料

小麦、玉米或其他谷物样品，风干、磨碎并通过 100 目铜筛。

四、操作步骤

1 ．标准曲线的绘制

取 6 支试管，编号，按下表加入试剂：

震荡 15min ，室温静置 30min ， 54Onm 比色，以蛋白质含量（ mg ）为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。

2 ．样品测定

（ 1 ）将磨碎过筛的谷物样品在 80 ℃下烘至恒重，取出置于燥器中冷却待用。

（ 2 ）称取烘干样品约 0.2g 两份，分别放入两个干燥的三角瓶中。然后在各瓶中分别加入 5ml 0.O5mol ／ L 的 NaOH 溶液湿润，之后再加入 20ml 的双缩脲试剂，震荡 15min ，室温静置反应 30min ，分别过滤，取滤液在 540nm 波长下比色，在标准曲线上查出相应的蛋白质含量（ mg ）。

从标准曲线上查得的蛋白质含量 (mg )

五、结果处理

六、注意事项

1 ．三角瓶一定要干燥，勿使样品粘在瓶壁上。

2 ．所用酪蛋白需经凯氏定氮法确定蛋白质的含量。

七、思考题

双缩脲法测定蛋自质含量的原理是什么？

双缩脲法测定蛋白质浓度

――生物化学实验

一、目的

了解并掌握双缩脲法测定蛋白质浓度的原理和方法。

二、原理

具有两个或两个以上肽键的化合物皆有双缩脲反应(蛋白质分子中有-CS-NH2, -CH2-NH2, -CHNH2CH2OH等基团，这些基团亦可与碱性高价铜呈颜色反应)，在碱性溶液中蛋白质与Cu2+形成紫色配合物，在540m处有最大吸收。在一定浓度的范围内，蛋白质浓度与双缩脲反应所呈的颜色深浅成正比，可用比色法定量测定。

双缩脲法最常用于需要快速但不要求十分精确的测定。硫酸铵不干扰此呈色反应，但Cu2＋离子容易被还原，有时会出现红色沉淀。 三、实验仪器

1．容量瓶10ml(×6)。

2．试管1.5cm×15cm(×8)。

3．吸管5.0ml(×3)、2.0ml(×1)。 4．722型(或7220型)分光光度计。 四、实验试剂

1、双缩脲试剂：将0.175g CuSO4·5H20溶于约15ml蒸馏水，置于l00ml容量瓶中，加入30ml浓氨水30ml冰冷的蒸馏水和20ml饱和氢氧化钠溶液，摇匀，室温放置1～2h，再加蒸馏水至刻度，摇匀备用。

2、卵清蛋白液：约lg卵清蛋白溶于l00ml 0.9％NaCl溶液，离心，取上清液，用克氏定氮法测定其蛋白质含量。根据测定结果，用0.9％NaCl溶液稀释卵清蛋白溶液，使其蛋白质含量为2rng/ml。亦可用2mg/ml的牛血清白蛋白溶液。 3、未知液：可用酪蛋白配制。 五、操作

1、标准曲线的绘制：将6只10ml容量瓶编号，按下表加入试剂，即得6种不同浓度的蛋白质溶液。

取干净试管7支，按0、1、2、3、4、5、6编号，1～6号管分别加人上述不同浓度的蛋白质溶液3.0ml。0号为对照管，加入3.0ml蒸馏水。各管加人双缩脲试剂2.0ml，充分混匀，即有紫红色出现，用540nm光测定各管吸光度(须在显色后30min内比色，30min后可能有雾状沉淀产生；各管由显色到比色的时间尽可能一致)。绘制浓度一吸光度曲线。

2、样液测定：

取未知浓度的蛋白质溶液3.0ml(样品液浓度控制在0.05-1.25mg/ml范围内)置试管内，加入双缩脲试剂2．0ml，混匀，测其540hm的吸光度，对照标准曲线求得未知液蛋白质浓度。

六、思考题

1、写出双缩脲反应的方程式。

2、简述用分光光度法测定蛋白质浓度的原理。

3、总结本实验应该注意的主要问题。

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