双歧杆菌的分离鉴定及保藏性能研究

乌云，刘红霞，李洪亮，母智深*

（内蒙古蒙牛乳业（集团）股份有限公司，内蒙古呼和浩特011500）

摘 要：为丰富发酵剂及益生菌菌种资源，从内蒙古阿拉善盟采集7份新生婴儿粪便样品，在传统细菌分离方法的基础上，通过添加莫匹罗星锂盐和X-Gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷）改良基础培养基，快速有效地分离获得双歧杆菌。结合全自动微生物分析系统和API20A试剂条鉴定菌种。结果共分离获得6株双歧杆菌，其中3株动物双歧杆菌，2株青春双歧杆菌，1株短双歧杆菌。试验验证甘油浓度为70%时冷冻保藏效果最佳。

关键词：双歧杆菌；全自动微生物分析系统；API20A试剂条；冷冻保藏

双歧杆菌是存在于人体肠道中的益生菌，在长期进化过程中与宿主形成了互惠共存的关系，具有改善肠道健康、增强免疫功能、防治便秘腹泻、缓解乳糖不耐、促进营养物质吸收、降三高和抗肿瘤等多种保健功能[1-4]。在食品领域，卫生部文件将其列入《可用于食品的菌种名单》、《可用于保健食品的菌种名单》及《可用于婴幼儿食品的菌种名单》，现今市场上已有益生菌发酵饮料、益生菌酸奶、益生菌奶粉奶片等多种品类。在临床上，双歧杆菌活菌制剂已经广泛应用于腹泻和便秘等肠胃疾病的治疗[5]。双歧杆菌类益生菌产品日益得到消费者的追捧，分离筛选一些优秀的双歧杆菌是该类产品开发应用的基础。

不同细菌具有各自特有的酶系统，对各种营养物质的代谢能力也不尽相同，通过生理生化反应测试区分鉴别细菌的种属是细菌鉴定的最原始手段。全自动微生物分析系统，即是由传统检测鉴定技术与现代计算机技术相结合，运用概率最大近似值模型法计算，仪器自动鉴定的技术[6-7]。目前，梅里埃Vitek 2 Compact全自动微生物分析系统，西门子MicroScan Walk Away 96 plus全自动微生物鉴定系统，基质辅助激光解析电离飞行时间质谱仪（matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS）开始普遍应用于辅助医疗、卫生防疫、疾病控制等诸多方面，在食品工业中的应用也正在兴起[8-11]。代敏等采用常规生化鉴定法、全自动微生物分析系统鉴定法和16S rDNA序列分析法对120株奶牛乳腺炎病原菌进行鉴定，比较分析了3种鉴定方法的优缺点[12]。研究结果显示，全自动微生物分析系统鉴定法自动化程度高，比常规生化鉴定法简便快捷，鉴定效率高，但部分阳性菌株的鉴定率较低。而16S rDNA序列分析技术可以对难以鉴定的种属进行鉴定，但易受PCR扩增和测序等操作技术的影响，对测试人员专业性要求较高。刘潇忆等讨论了原料乳中几项微生物指标的鉴定方法，提出快速检测和鉴定原料乳中微生物是保证产品品质的首要保障，全自动微生物分析系统是食品安全检测体系中快速有效的工具[13]。

双歧杆菌是严格厌氧菌，从多菌共存样品中分离较为困难。本研究以7名新生婴儿粪便样品为菌种来源，通过添加莫匹罗星锂盐抑制一些肠道细菌，添加X-Gal区分菌落色泽快速有效地分离获得双歧杆菌[14]，应用Vitek 2 Compact全自动微生物分析系统和API20A试剂条鉴定菌种，以期为日后的研究和应用提供菌种资源。

从内蒙古阿拉善盟共采集7份新生儿粪便样品作为试验样本。详细样本信息见表1。

表1 样品来源婴儿信息表Table 1 Sample source information sheet

样品编号 数/d 体重/kg身高/cm BMI值 性别 生产方式A 1 4.3 52.4 15.6 女 顺产B 2 3.7 47.6 16.3 女 剖腹产C 1 3.7 46.8 16.8 女 顺产D 2 3.9 46.2 18.2 男 剖腹产E 1 3.8 45.7 18.1 女 顺产F 2 2.9 44.7 14.5 女 剖腹产G 3 4.0 50.8 15.5 男 顺产样本来源新生婴儿信息出生天

分离纯化培养基：改良TPY/BS琼脂培养基（莫匹罗星锂盐添加量为50 mg/L，X-Gal添加量为60 mg/L）；

活菌计数培养基：TPY琼脂培养基；

增菌培养基：TPY液体培养基；

鉴定培养基：哥伦比亚血平板；

缓冲蛋白水溶液（每升）：10 g蛋白胨，5 g NaCl，2 g Na2HPO4，2 g KH2PO4[15]。

SVE-6A1超净工作台：新加坡ESCO公司；DM 2500显微镜：德国LEICA公司；HV-110高压灭菌器：日本HIRAYAMA公司；U410-86超低温冰箱：英国NEW BRUNSWICK公司；Vitek 2 Compact全自动微生物分析系统、API 20A试剂条、厌氧盒及厌氧袋：法国梅里埃公司。

样品采集：使用无菌旋盖离心管采集7份新生儿粪便样品，取样时应避免样品暴露于空气中，离心管旋盖拧松正置于试管架上放入厌氧盒中，尽量短的时间内带回实验室进行分离。

样品稀释：称量1 g粪便样品溶解于99 mL缓冲蛋白水溶液中，用十倍稀释法制备10-3～10-6样品稀释液。

取10-3～10-6样品稀释液0.1 mL涂布于添加莫匹罗星锂盐和X-Gal的改良TPY/BS琼脂平板，倒置于厌氧盒37℃培养48 h～72 h。挑取蓝色菌落进行耐氧试验，选择只在厌氧条件下生长的菌落划线纯化2代～3代，挑单菌落接种于TPY液体培养基中（上层用液体石蜡隔离空气），37℃恒温培养24 h。

形态学鉴定：菌株进行革兰氏染色，油镜观察菌体颜色、形态、排列情况等特征，初步鉴定为双歧杆菌。

Vitek 2 Compact全自动微生物分析系统鉴定：上机前先确保菌株纯培养，从TPY平板上挑取一个单菌落划线于哥伦比亚血平板上，37℃厌氧培养48 h。无菌棉签蘸取菌落研磨在0.45%NaCl溶液中配成2.7 McF～3.0 McF菌悬液，选择厌氧菌鉴定卡（ANC卡）上机测试。

API20A试剂条鉴定：挑单菌落划线于TPY平板上，挑菌落制成3.0 McF菌悬液，按要求加入试验条管并用石蜡油覆盖封口，37℃厌氧培养48 h，分别在24 h和48 h后判读结果，借助鉴定软件进行分析。

双歧杆菌接种到TPY液体培养基中增菌，37℃培养48 h→离心沉淀法收集菌体（4 000 r/min，10 min）→弃去上层清液，下层菌液与纯甘油按不同比例进行混合，反复吹吸使充分包裹→分装于无菌冻存管，每管1 mL→置于-80℃冰箱中保藏→定期取管测活菌数。

存活率/%=冻存数天后的活菌数/冻存前的活菌数×100

用缓冲蛋白水溶液进行10倍梯度稀释，TPY平板倾注，37℃厌氧培养48 h～72 h。每个稀释梯度做3个平行，计算菌落的平均数。活菌数=菌落平均数×稀释倍数。

分离前先对比了双歧杆菌在TPY、BS和MRS琼脂平板上的生长情况，双歧杆菌菌悬液涂布培养时菌落直径 dBS＞dMRS＞dTPY，但活菌数 QTPY＞QBS＞QMRS，因此选择改良TPY琼脂培养基进行分离。分离平板上菌落呈现深蓝色、浅蓝色、白色3种颜色。培养基中添加了莫匹罗星锂盐，可以抑制样品中大肠杆菌、肠球菌和其它肠道细菌的生长，但不影响双歧杆菌的生长。在严格厌氧的条件下培养，双歧杆菌生长良好，有效的利用X-Gal释放吲哚使菌落变蓝色[16-17]。7份样品共挑选36个蓝色菌落进行耐氧试验，共获得9株只在厌氧条件下生长的菌株。TPY平板划线纯化后观察，菌落微小（直径0.37 mm～0.54 mm）、圆形、凸起、表面光滑且边缘整齐，呈乳白色或半透明。分离纯化显色情况及菌落形态见图1。

图1 分离显色情况及菌落形态Fig.1 Separation of color and colony morphology

挑单菌落涂片进行革兰氏染色，油镜下观察呈现为多形态杆菌，有长杆、短杆、Y型菌、X型菌、V型菌同时存在，有的一端大呈棒状，9株疑似菌株镜检形态见图2。

图2 分离菌株镜检形态Fig.2 Specimens of the isolate strain

采用Vitek 2 Compact全自动微生物分析系统鉴定菌种，较传统生化鉴定方法具有操作简单、报告详细、降低人为误差、准确度高等优点，且试验用时较短，可在3 h～6 h之内出具鉴定分析报告。9株疑似菌株的Vitek 2 Compact鉴定结果见表2。

表2 分离菌株Vitek 2 Compact鉴定结果Table 2 Vitek 2 Compact identification results of the isolate strains

注：鉴定可信度（ID值）表示测试菌株与鉴定菌种数据库中典型菌株之间的比较，代表是该典型菌株的可能性。ID值越接近100%越可信。

菌株编号 Vitek 2 Compact鉴定结果 鉴定可信度/%A4 双歧杆菌属 98 A5 双歧杆菌属 91 C3 双歧杆菌属 98 D4 双歧杆菌属 86 E3 未鉴定出结果 0 E5 双歧杆菌属 97 F3 发酵乳杆菌 93 G4 双歧杆菌属 85 G6 发酵乳杆菌 91

全自动微生物分析系统的生化鉴定是根据不同微生物的理化性质不同，采用光电比色法，测定微生物分解底物导致pH值变而产生的不同颜色，来判断反应的结果，一旦鉴定卡内的终点指示孔到达临界值，则指示此卡已完成鉴定[18]。在鉴定过程中，每10分钟进行一次比色侦测，读取颜色改变并绘制建立反应曲线，系统最后一次读数后，将所得的生物数码与菌种数据库标准菌的生物模型相比较，得到相应系统鉴定值（ID值），按此值的大小对检测可信度作出评价。在每个菌群中，按ID值大小顺序排列，若概率百分比为85%～99%，鉴定结果是可以接受的，而概率百分比小于85%时为不可接受的鉴定。其中96%～99%为“极好的鉴定”，93%～95%为“非常好的鉴定”，89%～92%为“好的鉴定”，85%～88%为“可接受的鉴定”。数值越接近99%，表示越接近特定菌的典型模式[19]。9株疑似菌鉴定，除E3未鉴定出结果外，其余8株菌的鉴定可信度均大于85%，是可接受的鉴定结果。

Vitek 2 Compact全自动微生物分析系统完成菌种鉴定的同时，可提供36种生理生化反应结果，为菌株特性研究提供参考。鉴定分析报告显示，6株双歧杆菌的生化反应不尽相同，详见表3。

表3 6株双歧杆菌的生化反应结果Table 3 Biochemical reactions of 6 bifidobacterum

注：+表示阳性反应，-表示阴性反应。

反应孔编号 测试反应物 A4 A5 C3 D4 E5 G4 4 dGAL 半乳糖 + + + - + -5 LeuA 亮氨酸芳胺酶 + + + + + +6 ELLM L-半胱氨酸盐酸盐 - + - - - -7 PheA 苯丙氨酸芳胺酶 + + + + + +8 ProA L-脯氨酸芳胺酶 + + + + + +10 PyrA L-吡咯烷酮芳胺酶 - - - - - -11 dCEL D-纤维二糖 + - + - + -13 TyrA 酪氨酸芳胺酶 + + + + + +15 APPA 丙氨酸-苯丙氨酸-脯氨酸芳胺酶 + + + + + -18 dGLU 葡萄糖 + + + - + -20 dMNE 甘露糖 + - + - + -22 dMAL 麦芽糖 + + + + + +28 SAC 蔗糖 + + + + + +30 ARB 熊果甙 + - - - + -33 NAG N-乙酰-D-氨基葡萄糖 - - - - - -34 BGLUi 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-葡萄糖苷 + - + + + +36 URE 尿素酶 - - - - - -37 BGURi 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-葡糖苷 - - - - - -39 BGALi β-半乳糖吡喃糖苷酶 + + + + + +41 AARA α-阿拉伯糖苷酶 + + + + + -42 AGALi 5-溴-4-氯-3-吲哚-α-D-半乳糖苷 + + + + + +43 BMAN β-甘露糖苷酶 - - - - - -44 ARG 精氨酸 - - - - - -45 PVATE 丙酮酸盐 - - - - - -51 MTE 麦芽三糖 + + + + + +53 ESC 七叶苷水解 + - + + + +54 BdFUC β-D-岩藻糖苷酶 + + + + + +55 BNAGi 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-N-乙酰-葡萄糖胺 - - - - - -56 AMANi 5-溴-4-氯-3-吲哚-α-D-甘露糖苷 - - - - - -57 AlFUC α-L-岩藻糖苷酶 - - - - - -59 PHOS 磷酸酶 - - - - - -60 lARA L-阿拉伯糖 - + - - + -61 dRIB2 d-核糖 + + + + + +62 OPS 苯基磷酸盐 - - - - - -63 AARAF α-L-阿拉伯糖苷 + + + + + +64 dXYL D-木糖 + + + + + -

然而，Vitek 2 Compact全自动微生物分析系统数据库中菌种数量有限，只能鉴定到双歧杆菌属，需要借助API20A试剂条进一步区分，确定其“种”分类学地位。

API20A试剂条是针对厌氧菌的鉴定系统，可以将双歧杆菌鉴定到种。分离菌株API20A鉴定结果见表4。

表4 分离菌株API20A鉴定结果Table 4 Identification results of API20A

注：鉴定可信度（ID值）表示测试菌株与鉴定菌种数据库中典型菌株之间的比较，代表是该典型菌株的可能性。ID值越接近100%越可信。

菌株编号 Vitek 2 Compact鉴定结果API20A鉴定结果 鉴定可信度/%A4 双歧杆菌属 乳双歧杆菌 98.1 A5 双歧杆菌属 长双歧杆菌 91.9 C3 双歧杆菌属 青春双歧杆菌 93.8 D4 双歧杆菌属 乳双歧杆菌 99.1 E5 双歧杆菌属 乳双歧杆菌 95.4 G4 双歧杆菌属 青春双歧杆菌 97.9

API20A试剂条是厌氧菌鉴定的工具，原理是通过还原糖显色反应判断菌种代谢糖的能力，通常测试时间为24 h～48 h。测试需先通过肉眼观察颜色反应，记录数据，再应用软件与数据库中典型菌株进行比对，确定鉴定结果[20]。ID%＞80.0%的鉴定结果是可以接受的，其中ID%≥9.9%为“极好的鉴定”，ID%≥99.0%为“很好的鉴定”，ID%≥90.0%为“好的鉴定”，ID%≥80.0%为“可接受的鉴定”。数值越接近99.9%，表示越接近特定菌的典型模式。6株菌的鉴定可信度均大于90.0%，结果可信。

菌种保藏时通常选择甘油作为保护剂，因为甘油分子的羟基可与菌体表面的自由基联结，阻断菌体直接暴露；另外甘油中的小分子能渗透到菌体细胞内部，减少细胞的脱水收缩抑制冰晶形成，从而起到保护作用[21]。冷冻保藏期间甘油对活菌数的影响见表5，保存期间菌株的存活率见表6。

表5 不同浓度甘油保存期间活菌数对数值Table 5 Number of bacteria in different storage conditions

注：角标中字母不同表示数据之间差异显著（P＜0.05），其中字母abcd代表列数据分析，字母xyzwv代表行数据分析。

甘油浓度/%活菌数对数值[log（cfu/mL）]0 d 30 d 60 d 90 d 120 d 30 9.26±0.03x，c9.10±0.01y，d8.98±0.04z，d8.80±0.01w，d8.66±0.04v，c40 9.25±0.06x，c9.06±0.04y，d8.98±0.03z，d8.91±0.03w，e7.90±0.06v，d50 9.24±0.01x，c9.05±0.04y，e8.98±0.04y，d8.93±0.04z，d8.96±0.02y，b60 9.25±0.03x，c9.18±0.06y，c9.08±0.06z，c9.08±0.04z，c9.04±0.04z，b70 9.33±0.01x，ab9.31±0.02x，ab9.30±0.01x，ab9.30±0.06x，b9.31±0.06x，a80 9.38±0.03x，a9.36±0.04x，a9.36±0.04x，a9.33±0.02x，a9.35±0.01x，a90 9.32±0.04x，b9.30±0.03x，b9.29±0.06x，b9.30±0.04x，b9.31±0.04x，a

表6 冷冻保藏期间菌株的存活率Table 6 Survival rate of strains during the preservation

注：角标中字母不同表示数据之间差异显著（P＜0.05），其中字母abcd代表列数据分析，字母xyzwv代表行数据分析。

甘油浓度 0 d 30 d 60 d 90 d 120 d 30 100±2.6x，a70.2±1.0y，c53.2±2.7z，d35.1±0.9w，e25.5±2.3z，e40 100±3.8x，a65.2±2.1y，d54.2±2.1z，d46.1±1.2w，d44.9±3.1w，d50 100±1.0x，a64.5±2.2y，d55.6±2.8z，d49.2±2.4w，d53.0±1.4z，c60 100±1.8x，a86.4±3.4y，b68.8±3.7z，c67.6±2.1z，c61.9±2.8w，b70 100±1.1x，a95.4±1.4y，a93.1±0.8yz，b90.3±3.9z，b91.7±3.3yz，a80 100±2.0x，a95.8±1.8y，a95.4±2.1y，ab96.3±1.2y，a93.8±0.7y，a90 100±2.4x，a97.1±2.1x，a99.0±3.2x，a96.1±2.6x，a95.7±2.1x，a

根据表5，菌株保存期间活菌数有不同程度地减少，行数据显著性分析结果显示，甘油浓度小于70%时，活菌数随保存时间的变化显著，而甘油浓度大于70%时，变化不显著。说明当甘油浓度大于70%时，冷冻保藏可以保证较高的活菌数，达到很好的保护效果。列数据显著性分析结果显示，甘油浓度小于70%时，不同浓度甘油的保护效果差异显著；而甘油浓度大于70%时，差异不显著。冷冻保藏期间菌株的存活率见表6。

表6更直观地体现出菌株保存期间存活率的变化情况，存活率与甘油浓度呈线性关系，甘油浓度越大，对菌种的保护性越好。甘油浓度大于70%时，冷冻保藏 120 d 活菌数仍高达 1×109～2×109，存活率在 90%以上；甘油浓度小于70%时，活菌数下降迅速，存活率较低。虽然甘油浓度越高保护效果越好，但浓度过高时，保护液的黏度较高，试验操作时很难使菌体分散均匀，影响保存效果。因此认为70%甘油对双歧杆菌的保护效果最佳，菌种于-80℃冻藏120 d后仍能有效活化，且活菌数高达 2×109。

双歧杆菌对生长条件及营养的要求较苛刻，从多菌混合样品中分离获得双歧杆菌难度较大，分离培养基中除含有丰富的维生素、氨基酸、糖类及缓冲盐类等必需营养物质外，还需要添加双歧杆菌增殖因子L-半胱氨酸。另外，通过添加莫匹罗星锂盐来抑制其他微生物的生长，并结合X-Gal的显色作用快速准确的分离获得双歧杆菌。经鉴定，共分离获得6株双歧杆菌，其中3株动物双歧杆菌，2株青春双歧杆菌，1株短双歧杆菌。

菌株鉴定过程中，首先选择全自动微生物分析系统鉴定法，该方法自动化水平高、操作简便、用时较短、试验报告非常详细。但其数据库有局限性，双歧杆菌只能鉴定到属水平，需要结合API试剂条补充鉴定。API试剂条数据库较Vitek 2 Compact数据库菌株丰富，但需要繁杂的人工操作，观察时间长且肉眼观察误差较大。而先进的分子生物学技术从基因水平鉴定细菌种属，快速准确，但所需试剂和仪器昂贵，对操作人员专业性要求较高，企业广泛推行难度较大。因此，希望能尽快扩充全自动微生物分析系统的数据库，以便更好地应用在微生物检测鉴定领域。

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Isolation，Identification of Bifidobacterium and Preservation Ability Research

WU Yun，LIU Hong-xia，LI Hong-liang，MU Zhi-shen*（Inner Mongolia Mengniu Dairy（Group）Co.，Ltd.，Huhhot 011500，Inner Mongolia，China）

Abstract：In order to enrich more types of leavening agents and probiotics resources，faeces collected from seven infants（Alashan，Inner Mongolia）were investigated.On the basis of traditional bacterial separation method，Mupirocin lithium salt and X-Gal were added to the basic medium，to separate the bifidobacterium effectively.Automatic microorganism analytical system and API20A reagent strip were applied to identify the bifidobacterium.In total，six strains of bifidobacterium were obtained from infacts'faeces，among which three strains were Bifidobacterium lactis，two strains were Bifidobacterium adolescentis，and one strain was Bifidobacterium breve，and the optimum storage condition for the bifidobacterium is 70%glycerol.

Key words：Bifidobacterium；automatic microorganism analytical system；API20A reagent strip；freezing preservation

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2017.23.033

基金项目：内蒙古科技项目（201502056）

作者简介：乌云（1988—），女（蒙古），工程师，硕士，研究方向：乳制品加工、乳酸菌研究。

*通信作者：母智深（1968—），男，教授，博士，研究方向：乳与乳制品加工、食品微生物、食品功能性成分。

收稿日期：2017-09-13