ELISA试剂盒一站式解决方案

ELISA 原理

ELISA 的优缺点

ELISA 类型

直接 ELISA

间接 ELISA

竞争 ELISA

夹心 ELISA.

不同类型 ELISA 的优缺点

SimpleStep ELISA®试剂盒

ELISA datasheet关键点介绍

ELISA所需的对照样品

ELISA 分析

计算和评估ELISA数据

ELISA试剂盒实用技巧

ELISA疑难解答及优化方案

ELISA专业术语

ELISA 表示酶联免疫吸附测定，也经常被称为酶免疫分析 (EIA)。ELISA 和其他类型的免疫测定法一样，依靠抗体并利用高度特异性的抗体-抗原相互作用来检测靶抗原。在 ELISA 测定中，抗原必须被固定于固体表面上。这可通过直接固定抗原或者使用自身固定在表面上的捕获抗体实现。接着将抗原与检测抗体结合，该检测抗体与适用于检测的分子例如酶或荧光团偶联。

ELISA 测定通常在多孔板中进行（96 或 384 孔）。多孔板提供了固定抗原的固体表面。分析物的固定促进了抗原与样品中的其余组分分离。这种特性使 ELISA 成为最简单的同时检测多个样品的方法之一。

高灵敏度和特异性：因为使用了抗体，所以ELISA 通常可以非常特定的方式检测皮克级(pg)的–抗原。

临时读数：检测基于酶/底物反应，因此必须在很短时间内获得读数。

高通量：商业 ELISA 试剂盒通常采用 96 孔板形式。但是测定能够轻松适用于 384 孔板。

有限的抗原信息：仅限于样品中抗原的数量或存在的信息。

操作简单：实验方案简单易行且操作用时极短。

定量：能够确定样品中的抗原浓度。

可以测试各种样品类型：血清、血浆、细胞和组织提取物、尿液和唾液等。

ELISA 测定可具有多种形式，每一种各有优缺点。下图描述了 ELISA 的四种主要的不同类型。

将抗原固定于多孔板表面，用特定于该抗原并且直接偶联到 HRP 或其他检测分子的抗体检测。

与直接 ELISA 测定相似，将抗原固定于多孔板表面。但是，检测需要两步过程，通过该过程先将特定于该抗原的一抗结合到靶标，然后将针对一抗的宿主物种的标记二抗与一抗结合进行检测。

该方法还可用于通过用血清代替一抗来检测血清样品中的特定抗体。

夹心 ELISA（或夹心免疫测定法）是最常用的形式。这种形式需要特定于该抗原的不同表位的两种抗体。  这两种抗体通常被称为匹配抗体对。其中一种抗体包被于多孔板表面上并用作捕获抗体以促进抗原的固定。另一种抗体被偶联并促进抗原的检测。

也被称为抑制 ELISA 或竞争免疫测定法，这种测定法通过检测信号干扰测量抗原浓度。前面的每一种形式都适用于竞争形式。样品抗原与参考抗原竞争结合到特定量的标记抗体。参考抗原预包被于多孔板上。将样品用标记抗体预孵育并加入孔中。根据样品中抗原的量，将有更多或更少的游离抗体可用于结合参考抗原。这意味着，样品中的抗原越多，检测到的参考抗原就越少，信号就越弱。

一些竞争 ELISA 试剂盒使用标记抗原代替标记抗体。标记抗原和样品抗原（未标记）竞争结合到一抗。样品中抗原的量越少，则因孔中的更多标记抗原产生的信号就越强。

节省时间且不会影响检测性能。使用单步洗涤方案升级您的ELISA，获取兼具特异性和灵敏度的结果。

传统

ELISA试剂盒

SimpleStep

ELISA® 试剂盒

灵敏度

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液相反应系统带来更高的灵敏度

重现性

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重组抗体提供更好的重现性

全面验证

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生物样品验证确保与内源性蛋白反应

快速简便的实验方案

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一次洗涤90分钟实验方案，减少处理步骤

在SimpleStep ELISA®试剂盒中，分析物-捕获抗体和检测抗体夹心复合体形成于溶液中。仅需一次孵育和一次洗涤，即可在孔中形成完整的夹心复合体，并通过免疫亲和标签将其固定至微孔板上。

传统夹心ELISA利用的是一对能够结合于靶蛋白上至少两个不同位点的抗体。捕获抗体预包被于微孔板的微孔表面，并与靶蛋白选择性结合，清洗后，加入检测抗体，连接到靶蛋白的第二位点，形成夹心复合物。

SimpleStep ELISA®试剂盒通过使用均相(homogeneous format)形式简化上述过程，该方法仅需一步即可在溶液中形成抗体 – 分析物夹心复合物。且仅需一次孵育和一次清洗，即可在孔中形成完整的夹心复合体，并通过免疫亲和标签将其固定至微孔板上。

在SimpleStep ELISA ®试剂盒中，分析物、捕获抗体和检测抗体夹心复合体形成于溶液中，其通过夹心对中捕获抗体上附接的亲和标签与微孔板结合。请观看介绍SimpleStep ELISA®工作原理的视频。

SimpleStep ELISA®试剂盒可在不影响分析性能的前提下大幅缩短检测时间。我们比较了SimpleStep ELISA®试剂盒与最受欢迎竞争企业品牌的ELISA试剂盒测定75种常见的人类和小鼠蛋白的灵敏度。在75例测定中，有56例显示SimpleStep ELISA®试剂盒的灵敏度更高。

每一个SimpleStep ELISA®试剂盒的特异性都通过多种生物样品被验证。所有分泌于血清和血浆中的靶标经过测试，均在世界卫生组织血液参考范围内。在可行的形况下，根据已知的NIBSC国际标准对SimpleStep ELISA®试剂盒进行校准，包括对数据对比的转换因子进行校准。

SimpleStep ELISA®试剂盒目前可测定包括PD-L1、GFP和纤维蛋白原等常见蛋白在内的近600中靶蛋白，并且还在不断扩展。

已经开发出了CatchPoint SimpleStep ELISA®试剂盒。与比色ELISA试剂盒相比，该试剂盒使用荧光底物，能在更大的动态范围内提供改善的线性度。更大的动态范围在曲线的上端和下端都提供了更好的定量结果。

登录www.abcam.com/catchpoint-simplestep-elisa-kits可了解更多信息

①灵敏度（Sensitivity）是指 ELISA 试剂盒抗体对可检测的最低蛋白变化水平。例如此试剂盒可检测样本间靶蛋白浓度差异最低范围是1.6 pg/ml。

②范围（Range）是检测可准确量化的靶蛋白低浓度到高浓度区间。例如此试剂盒可检测样本中靶蛋白范围是7.8 pg/ml - 500 pg/ml。

*了解样品中预计的靶蛋白水平非常重要，这可以帮助检查给定的 ELISA 试剂盒灵敏度及动态范围是否合适。如果样品靶蛋白浓度很高，可以对样品进行稀释，以确保原始信号在测定的动态范围之内。

③样品类型（Sample type）是指试剂盒可检测的样本种类。例如该试剂盒可检测细胞培养上清、Cit血浆、EDTA血浆和血清 。

④种属反应性（Reacts with）是指试剂盒用于检测的种属范围。例如该试剂盒可用于检测人源样本。

⑤精确度CV (%) 或变异系数代表了测定的一致性。CV 的计算主要是用于评估批间精度或板间一致性，以及批内精度或同一实验中重复测定结果的一致性。 它包括批内精度 CV (%)和批间精度 CV (%)。

*批间 CV 百分率小于 15% 通常是可以接受的。

*批内 CV 百分率应低于 10%。

⑥回收率(%)是通过给一份生物样品类型（同时也称样品基质）里加入已知数量的纯化靶蛋白而确定的。对于分泌蛋白，比如细胞因子，常见的样品基质有血浆及血清；对于细胞内蛋白，比如激酶，样品是细胞培养裂解物。

测量 ELISA 中的加标样品，并通过标准曲线计算浓度。将计算的浓度与已知的蛋白浓度进行比较，以百分比的形式呈现。比如100% 回收率表示观察浓度与样品里加标蛋白的实际浓度一致。这表明同一样品类型中的其它蛋白及分子并未干扰靶蛋白的量化。

如果对于某一特定样品类型，回收率测量值小于80%，则需要选取另一套不同的 ELISA 试剂盒以供量化。

⑦测定特异性（ASSAY SPECIFICITY）通常会描述产品比较特别的注意点。例如，该试剂盒只识别血清、血浆和细胞培养上清样品中的天然和重组人IL-6蛋白。 细胞和组织提取样本未使用此试剂盒进行测试。

⑧交叉反应性指抗体对与非靶蛋白的结合程度。理想情况下应 16孔)，MDD是最好的计算方法。MDD应该总是小于标准曲线的最低点数值。

特异性

抗体能结合特定蛋白质和物种的特异性表位的标志。

加标回收

靶标蛋白加入生物基质后是否可回收的试验。加标回收可以在生物基质中识别出，那些通过与靶标蛋白互作方式影响抗体与靶标蛋白结合的未知因子。如果生物基质中存在影响靶标与抗体结合的因子，可回收到明显的增强或减弱减信号。

一般来说，回收信号的变化范围在-/+ 20%内是可接受的(即回收率80-120%)。生物基质中的加标回收率应与标准稀释液中加标回收率进行比较:如果在生物基质和标准稀释液中观察到的加标回收率相同，则认为该含量测定方法（试剂盒）是可以测定该样本基质中的靶标。

适用的生物样本（Supported biological samples）

出现无信号或信号低于标准曲线最低值的现象时，可以通过在样本中加入标准蛋白来测试样本与试剂盒的兼容性。利用这种方式进行测试是为了说明当待测样本含有足够内源靶标蛋白时，比如病人样本的靶标含量在试剂盒的动态范围内，试剂盒可以检测出信号，那么可确定该试剂盒适用于此类样本类型。

定量上限（ULOQ）

根据特定置信度可靠定量检测的最高蛋白浓度。为确定ULOQ，将标准曲线直线部分最高点数值均值与其十倍标准差求和，然后在标准曲线上插值这个和值来确定ULOD，这个和值应该小于15%CV。其与定量下限（LLOQ）一起界定含量测定（试剂盒）的定量范围。

已验证的生物样本（Validated biological samples）

已用产品和内源信号验证过可检测的样本类型。