带你“找不同”

在组织学中，石蜡切片和冰冻切片都是常用的方法，前者常用于进行免疫组化实验，后者则常用于免疫荧光实验。今天，小编就来带大家一起了解一下石蜡切片与冰冻切片。

优缺点对比

优点：能够较完好地保存多种抗原的免疫活性，尤其是细胞表面抗原更应采用冰冻切片。

缺点：制片过程中要经过酒精、二甲苯等有机溶剂处理，组织内抗原活性失去较多。

缺点：组织易碎易烂，完整切片结构较难获取；

冰冻时，组织中水份易形成冰晶，往往影响抗原定位。

短期低温保存。

解决方式：抗原热修复---柠檬酸盐缓冲液高温煮30min

（有效去除醛类固定试剂导致的蛋白之间的交联，充分暴露石蜡切片等

样品中的抗原表位，从而大大改善免疫染色效果）

解决方式：速冻------液氮

样本制备流程

1.4%多聚甲醛4℃固定过夜；

2.1xPBS洗一次，30min；

3.30%乙醇1小时,摇床上慢摇，下同；

4.50%乙醇1小时；

5.70%乙醇1小时；

6.85%乙醇1小时；

7.95%乙醇1小时；

8.95%乙醇1小时；

9.正丁醇1小时（打开65℃温箱溶蜡）；

10.正丁醇1小时；

11.正丁醇1小时；

12.石蜡65℃中处理3小时，每隔1小时换石蜡一次，包埋。

2.1xPBS洗一次，5min；

3.30%蔗糖沉降2小时；

4.OCT包埋。

常用固定液

不同的固定液对于固定不同的组织成分起着不同的作用，因此我们在使用时应该了解不同固定剂的效能，才能合理的固定组织。根据Bencroft的分类法，将不同的固定剂分为四种类型：

Ⅰ类：醛类，甲醛，戊二醛，多聚甲醛，丙烯醛，已二醛，丙二醛等。

Ⅱ类：氧化剂类，四氧化锇（奥酸），高锰酸钾，重铬酸钾等。

Ⅲ类：蛋白变性类，甲醇，乙醇，醋酸等。

Ⅳ类：其他，氯化汞，苦味酸等。

上述四种类型的固定剂，最常使用的是甲醛和多聚甲醛，其余的也在其它病理技术方面中用到。

甲醛与多聚甲醛固定的区别

（1）10%甲醛：对组织渗透性强，固定均匀。对组织膨胀约5%，经酒精脱水时有较大的收缩。能保存脂肪，不能沉淀核蛋白及白蛋白，长期用其固定的组织使组织变为酸性，不利于染色，特别是细胞核的着色。经自来水冲洗6~24小时后，可以使其酸碱中和，并减少结晶。

（2）4%多聚甲醛：对组织穿透性好，组织收缩小，对大多数抗原物质保存较好，特别是对脂肪和各种酶的固定效果更好。固定的时间不宜太长，以24小时以内为宜，适用于免疫组织化学染色。

石蜡切片机与冰冻切片机

注意事项:

首先检查切片机各部位是否已固定，刀片是否锋利;

用切片机切片时注意速度，太快易出现褶皱，可以提前将样品置于冰上冷却；

切片时发现纵向刀痕立即停止切片，清除刀片上的杂质或碎屑；

展片水温控制在42℃左右，过高蜡片弥散，过低蜡片不能展开；

新换的水需要加热到42度才能将蜡片放入，否则水温上升后易出现微小气泡，影响贴片；

展片槽水位应较高，防止玻片触底带起气泡，贴附于蜡片下影响贴片；

展片时间过短则蜡片不能完全展开；

展片时间过长则蜡片弥散，不利于贴片；

可用普通载玻片；

切片样品置于切片盒中敞开晾干后室温保存。

冰冻切片机

注意事项:

样品提前两小时从-80℃放置-20℃稳定样品状态，平衡样品温度；

冰冻包埋OCT液于室温呈液态，-15℃以下呈固态；

载玻片应置于室温，若长时间置于-20℃则组织将不能贴附;

必须使用粘附性载玻片；

撰稿：金恒薇

编辑：立花树月

审核：羽茜