TSA对内质网应激诱导线粒体损伤的影响及其机制

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作者：

李志平

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摘要：

内质网(Endoplasmic reticulum, ER)是真核细胞中一种重要的多功能膜性结构细胞器,在受到外界条件的刺激下产生内质网应激(Endoplasmic reticulum stress,ERS),ERS时会适应性地激活未折叠蛋白反应(Unfolded protein response, UPR)以协助细胞的自身修复.然而,长时间的应激则最终会导致细胞凋亡.在内质网应激诱导的细胞凋亡中,线粒体的改变也扮演着重要角色,即线粒体与内质网应激细胞的凋亡之间存在密切关系. 毒胡萝卜素(Thapsigargin, TG)是一种常用的内质网应激诱导剂,能特异性地抑制内质网Ca2+-ATPases(SERCA)扰乱细胞的Ca2+稳态,诱导细胞凋亡.在内质网应激时,葡萄糖调节蛋白78(Glucose regulated protein78, GRP78)是细胞内最先感受应激并激活UPR反应的蛋白.它最初被人们认为是一种存在于内质网中的蛋白,然而最近的研究发现,GRP78可以在不同种类的细胞中定位于线粒体等多种细胞器,并在不同条件下发挥着不同的生物学功能.如文献报道,小鼠脑肿瘤9L细胞在内质网应激条件下,GRP78会从内质网移位至线粒体,但其是否参与对应激细胞线粒体的保护并未进一步阐明. 线粒体是细胞中重要的能量代谢场所,由内外两层膜构成,通过三羧酸循环为细胞提供能量,维持细胞的正常生理功能.目前,对于ERS时细胞所执行的与凋亡相关的分子机制已得到了十分广泛的研究,但是在内质网应激条件下,探究线粒体功能损伤的相关报道还不多见. 曲古菌素A(TrichostatinA, TSA)是一种广谱的组蛋白去乙酰化酶抑制剂,可以通过抑制ERS细胞中的去乙酰化酶活性,调节应激细胞的乙酰化水平而调控相关基因的转录,保护应激细胞.已有研究表明,TSA在内质网应激时通过升高蛋白GRP78,Bcl-2,降低CHOP的表达,起到对心肌细胞的保护作用. 由此可知,TSA可以保护内质网应激细胞,而内质网又与线粒体在功能上密切相关,所以我们猜想,TSA在保护内质网应激细胞时,可能会通过与线粒体相关的途径,减少细胞凋亡. 实验目的: 本实验拟探究在TG诱导ERS条件下,TSA对H9c2细胞与线粒体相关的保护机制. 实验方法: 本实验以H9c2细胞为研究对象,通过CCK-8实验检测内质网应激诱导剂TG在不同剂量浓度下对H9c2细胞存活率的影响,并根据GRP78在不同时间的表达确定合理的应激诱导剂给药时间;采用流式细胞术,检测TSA在确定的浓度和时间条件下对内质网应激诱导的细胞凋亡的保护作用;采用JC-1染色法,并分别用荧光显微镜观察和流式细胞术定量,观察TSA对内质网应激诱导的线粒体膜电势降低的抑制作用;采用Western-blot法检测与线粒体损伤相关指标CytC的表达改变;采用免疫荧光及Western-blot技术,检测TSA对TG诱导的内质网应激细胞中GRP78的表达改变;采取免疫荧光与细胞器染色方法,检测GRP78蛋白在线粒体中的定位;采用亚细胞结构分离法,利用Western定量检测定位于线粒体中的GRP78. 实验结果: (1)TG工作浓度的确定:采用CCK-8法,TG对细胞的存活率呈剂量依赖性,其中1μM组存活率为:(88.31±3.60)%;2μM组的存活率为:(87.66±2.60)%,4μM组存活率为:(58.21±3.15)%,与对照组(98.23±2.1)%相比存在显著性差异(P