SOX5蛋白对公鸡精子发生和精子活力的作用及其定位

2024-07-16 16:40| 来源: 网络整理| 查看: 265

精子发生是一种复杂的细胞分化过程，包括雄性生殖细胞的一系列分子和形态学变化，且变化过程中也有许多蛋白的参与。一些参与精子发生的关键蛋白功能缺失会引起精子活力低下，甚至导致无精子症[1-2]。其中SOX蛋白的编码基因位于雄性动物Y染色体上，在个体发育过程中，广泛参与动物早期胚胎发育[3]、性别决定和分化[4]及精子生成[5]等过程，具有重要的生物学功能。SOX蛋白由具有HMG-盒(High mobility group box，HMG-box)保守区域构成的蛋白所组成，在很多种动物的组织中均有表达。SOX家族是一种重要的转录调控因子，其保守的HMG-box能够结合特定的DNA序列。根据HMG-box盒的同源程度可将SOX分为A、B、C、D、E、F、G、H、I和J 10个不同亚族[5]。

SOX5作为SOXD亚族的重要成员[5]，广泛存在于各种动物组织中，哺乳动物中包含长链(L-SOX5，6 kb)和短链(S-SOX5，2 kb)两个亚型。L-SOX5在心、肝、肌肉和脂肪等组织中存在[6-7]。S-SOX5则主要存在于睾丸等含有鞭毛细胞的组织中[8]。S-SOX5在睾丸减数分裂后的生殖细胞中表达，尤其是在精细胞阶段[8]。在家禽中，SOX5基因位于1号染色体上，含有19个外显子，序列变异会引起鸡冠形态变化[9]，但SOX5是否与精子活力相关，目前尚未见报道。

本研究通过RT-qPCR和Western blot技术探讨SOX5在不同发育阶段公鸡睾丸中表达差异，并比较正常公鸡与弱精子症公鸡睾丸中SOX5的差异。同时，采用免疫组织化学技术进行蛋白表达定位，旨在从分子水平探索SOX5在公鸡睾丸精子发生和精子活力中的作用。

1 材料与方法 1.1 试验材料

试验动物来自中国农业科学院北京畜牧兽医研究所昌平试验基地。选取0(出生24 h内)、5、15、40和60周龄的健康北京油鸡公鸡和40周龄弱精子症公鸡各5只，屠宰后迅速采集左侧睾丸，取中心部位样本(长1.0 cm×宽1.0 cm×高0.5 cm)放入甲醛固定液(10%福尔马林溶液)保存，用于制备组织切片，其余样本液氮速冻后，-80 ℃保存，用于后续试验。弱精子症公鸡筛选参考富丽等[10]和Y.Y.Wang等[11]方法。本研究中正常个体精子活力为75.3%，弱精子症个体精子活力为18.3%。

1.2 总RNA提取

利用RNA提取试剂盒(天根，北京)提取上述公鸡睾丸组织总RNA。用核酸定量仪NanoDrop2000(Thermo scientific，美国)测定浓度，通过A260 nm/A280 nm值计算RNA纯度。

1.3 cDNA合成和RT-qPCR

cDNA反转录参照Primer Script TM RT Master Mix(Perfect Real time)试剂盒(TaKaRa，美国)操作说明，反转录产物于-20 ℃保存备用。RT-qPCR以β-actin为内参基因，根据NCBI GenBank中鸡SOX5基因和β-actin基因序列设计引物，如表 1所示。采用7500型荧光定量PCR仪(ABI，美国)对SOX5和β-actin进行分析，RT-qPCR参照KAPA SYBR FAST Universal qPCR Kit(KAPA，美国)试剂盒说明书。每个样品设置2个技术重复。

表 1(Table 1) 表 1 RT-qPCR所用基因的引物信息 Table 1 Primer information of genes used in RT-qPCR 基因名称Gene name 登录号Accession number 引物序列(5′-3′) Primer sequence 产物大小/bp Product size 退火温度/℃ Tm SOX5 NM_001004385.1 F:TGGGCTAAAGATGAACGG 187 54 R:GCTTGTATTTGTAGTCTGGGT β-actin NM_001199586.1 F:GAGAAATTGTGCGTGACATCA 152 58 R:CCTGAACCTCTCATTGCCA 表 1 RT-qPCR所用基因的引物信息 Table 1 Primer information of genes used in RT-qPCR 1.4 总蛋白提取和浓度测定

取100 mg左右睾丸组织，加入10倍体积的RIPA裂解液(南京建成)，用高通量组织研磨器50 Hz 20 s，研磨3次。研磨后, 冰上静置15 min，不时摇晃。4 ℃，12 000 r·min-1离心15 min，取上清液即为总蛋白。所得样品总蛋白用BCA蛋白定量试剂盒(北京康为世纪)测定蛋白浓度，并用生理盐水将蛋白浓度均一化为2 μg·μL-1，分装，-80 ℃保存备用。

1.5 Western blot检测

取45 μg总蛋白，95 ℃变性10 min，4%~12% SDS-PAGE电泳分离。电泳结束后，将蛋白从凝胶转至PVDF膜(0.22 μm，Millipore，美国)上，用5%脱脂奶粉(BD，美国)室温摇床封闭30 min，分别加入1.5 μg的鼠源β-actin一抗(Abcom，英国，1:5 000)和兔源SOX5一抗(Abclonal，美国，1:200)，室温摇床孵育1 h。随后TBST洗涤3次，再分别加入2 μg的山羊抗鼠二抗(Abcom，英国，1:5 000)和山羊抗兔二抗(Abclonal，美国，1:200)，室温摇床孵育40 min，TBST洗涤3次。ECL超敏发光液(Coolaber，美国)孵育，Image Quant LAS4000mini仪器(GE，美国)凝胶成像仪器自动曝光，采集图像。

1.6 免疫组织化学方法

制作不同周龄公鸡睾丸组织石蜡切片，二甲苯脱蜡后再进行梯度酒精脱水。枸橼酸盐(柠檬酸三钠)热修复，然后加3% H2O2室温孵育，消除内源性过氧化物酶活性。5% BSA封闭1 h，PBS作为阴性对照孵育，加入兔源SOX5一抗(Abclonal，美国，1:200)室温孵化1 h，PBS洗涤后再加入山羊抗兔二抗(Abclonal，美国，1:200)室温孵化40 min。PBS洗涤后，加DAB显色2 min，PBS冲洗10 min。再使用苏木精复染，梯度酒精脱水，中性树胶封片，镜检观察。

1.7 数据分析

根据荧光定量所得到的Ct值，采用2-△△Ct方法进行处理[12]，利用SAS 8.0软件对数据进行单因素方差分析，Duncan’s多重比较检验组间表达量差异，P < 0.05表示差异显著。Western blot结果使用Image J图像分析软件分析，其中SOX5蛋白灰度值为SOX5蛋白IOD值和β-actin IOD值的比值。

2 结果 2.1 不同周龄公鸡睾丸中SOX5 mRNA的表达

如图 1所示，SOX5 mRNA在不同发育阶段睾丸中均有表达。随着周龄的增长，SOX5 mRNA表达量呈现先增长后下降的趋势，且15周龄睾丸中SOX5 mRNA表达量显著高于0、5和60周龄(P < 0.05)。

图 1(Figure 1) Figure 1 不同字母表示差异显著(P < 0.05)；n=5。下同 Different letters mean significant difference (P < 0.05); n=5. The same as below 图 1 SOX5 mRNA在不同发育阶段公鸡睾丸中的表达 Figure 1 The expression of SOX5 mRNA in the testis of roosters of different ages 2.2 40周龄正常公鸡和弱精子症公鸡睾丸中SOX5 mRNA的表达

40周龄弱精子症公鸡睾丸中SOX5 mRNA的表达量是正常公鸡的0.38倍，且差异显著(P < 0.05)(图 2)。

图 2(Figure 2) Figure 2 图 2 SOX5 mRNA在40周龄正常公鸡和弱精子症公鸡睾丸中表达 Figure 2 The expression of SOX5 mRNA in the testis of normal and asthenospermia roosters of 40 weeks of age 2.3 不同周龄公鸡睾丸中SOX5蛋白的表达

SOX5蛋白在不同发育阶段公鸡睾丸中均有表达，0周龄公鸡睾丸中，SOX5蛋白表达量最低，15周龄表达量最高，且呈现先增长后下降的趋势(图 3)，与mRNA表达结果一致。

图 3(Figure 3) Figure 3 1~5.0、5、15、40、60周龄 1-5.0, 5, 15, 40, 60 week 图 3 SOX5蛋白在不同发育阶段公鸡睾丸中表达 Figure 3 The expression of SOX5 protein in the testis of roosters of different ages 2.4 40周龄正常公鸡和弱精子症公鸡睾丸中SOX5蛋白的表达

40周龄正常公鸡睾丸组织中，SOX5的蛋白表达量高于弱精子症公鸡(图 4)，与mRNA结果一致。

图 4(Figure 4) Figure 4 图 4 SOX5蛋白在40周龄正常公鸡和弱精子症公鸡睾丸中表达 Figure 4 The expression of SOX5 protein in the testis of normal and asthenospermia roosters of 40 weeks of age 2.5 不同周龄公鸡和40周龄弱精子症公鸡睾丸中SOX5蛋白的表达与定位

在0和5周龄公鸡睾丸中，SOX5蛋白只在少量精原细胞和支持细胞中表达(图 5A，B)；15和40周龄公鸡睾丸中，SOX5蛋白在支持细胞、初级精母细胞、次级精母细胞、圆形精子细胞和成熟的精子均表达(图 5C，D)。与40周龄正常公鸡睾丸相比，弱精子症公鸡睾丸中SOX5蛋白表达较少(图 5D，E)。

图 5(Figure 5) Figure 5 A~D.0、5、15和40周龄正常公鸡；E.40周龄弱精子症公鸡；F.阴性对照。a.精原细胞；b.精母细胞；c.圆形精子细胞；d.成熟精子；e.支持细胞 A-D.Normal testis at 0, 5, 15, and 40 weeks of age; E. Asthenospermia testis at 40 weeks of age; F.Negative control. a. Spermatogonia; b. Spermatocyte; c. Spermatid; d. Mature sperm; e. Sertoli cell 图 5 SOX5在不同发育阶段公鸡和弱精子症公鸡睾丸组织的免疫组织化学结果(标尺：400 μm) Figure 5 Immunohistochemistry with SOX5 using the immunoperoxidase method and hematoxylin counterstain in the testis of roosters of different ages and asthenospermia roosters of 40 week(Scale bar: 400 μm) 3 讨论

精子鞭毛结构决定精子的运动能力，鞭毛也参与精子的形成过程，因此在精子发生周期中，鞭毛的正确构建较为关键[13]。在哺乳动物中，很多精子鞭毛基因已经被验证[14]。与哺乳动物不同，家禽是内部受精的卵生动物，有储存精子和多卵受精能力。所以了解其精子形成和活力的调控机理，有助于提高其繁殖能力。前期通过iTARQ蛋白质组学技术筛选出SOX5和SOX9等蛋白在正常公鸡和弱精子症公鸡睾丸中表达存在差异[15-16]。

SOX5在哺乳动物睾丸的生殖细胞中表达，并能调节细胞增殖、分化和精子发生等过程[8]。本试验发现SOX5在刚出生的公鸡睾丸中就表达，且随着周龄的增加，SOX5在睾丸中的表达呈现先上升后降低的趋势。同时SOX5在睾丸中的表达具有细胞特异性，在支持细胞、精原细胞、各级精母细胞、圆形精子细胞及成熟精子中都存在，且圆形精子细胞中表达量最高。刚出生公鸡睾丸中含有大量的支持细胞，而此阶段SOX5主要在支持细胞中表达。C.F.Liu等[17]研究发现，SOX5可激活SOX9，而SOX9主要存在睾丸的支持细胞中[18]，参与睾丸细胞增殖分化及维持睾丸功能等过程。SOX5和SOX9在鸡胚早期发育时期均表达[19]，对性别分化起决定性作用[20]。SOX5在15周龄公鸡睾丸中表达量最高，主要是由于公鸡在15周龄时处于性成熟期，睾丸含有大量的圆形精子细胞，并有少量的精子生成；30~50周龄是种鸡繁殖高峰期，SOX5表达量维持在较高水平；60周龄时，睾丸萎缩，精子生成减少[21]，这可能是SOX5表达相对较低的原因，本研究中SOX5基因和蛋白随着公鸡周龄增加的表达趋势与M.Daigle等[5]在小鼠上的研究结果一致。因此，早期发育过程中, SOX5表达量与生精细胞增殖分化有关，性成熟后，其表达量与精子生成呈正相关。

SOX5在40周龄正常公鸡睾丸的表达量显著高于弱精子症公鸡。在生精小管中，精原干细胞增殖分化、精母细胞减数分裂后形成成熟精子。其中CATSPER1、SPAG6和SPAG16基因敲除的细胞肌动蛋白骨架断裂[22-23]，从而影响纤毛迁移，小鼠精子丧失直线运动能力，精子活力差[24]。SPAG6在精母细胞、圆形精子细胞和成熟精子中均表达，而SOX5通过与CATSPER1和SPAG6等精子活力候选基因的启动子区域结合，进而调节精子活力[25-27]。因此，SOX5是精子鞭毛功能调节基因，鞭毛结构变化时精子生成、形态和运动都受到影响。由于弱精子症公鸡睾丸初级精母细胞、次级精母细胞、圆形精子细胞和成熟的精子比正常公鸡少，所以SOX5在40周龄弱精子症公鸡睾丸的表达显著低于正常公鸡，因此SOX5可以作为弱精子症潜在的生物标记。

4 结论

本研究表明，SOX5在公鸡各周龄的睾丸组织中均表达，SOX5表达量与生精细胞增殖分化有关；此外，SOX5的表达量可能会影响精子活力。这为进一步研究SOX5对精子发生和睾丸功能调节机制提供参考，也为治疗精子活力低下和睾丸损伤等疾病提供理论依据。

【本文地址】

公司简介

联系我们