人源抗体开发

2.1 制备人-鼠/人-人杂交瘤细胞将B细胞与骨髓瘤细胞融合是获得分泌抗体的永生化B细胞最常用的方法。早期通过利用人B细胞和小鼠骨髓瘤细胞融合获得人-鼠异源性杂交瘤细胞，但因建立细胞株困难而产量低，且在传代过程中很可能丢失某些人类染色体，存在不稳定性。研究者们广泛探索了可替代的融合伴侣细胞，这些融合伴侣细胞主要有鼠-人嵌合型骨髓瘤细胞系、人骨髓瘤细胞、人骨髓瘤细胞衍生细胞系和人淋巴母样细胞系。但是用这类融合伴侣细胞产生的人-人杂交瘤细胞不能有效兼顾产量和稳定性需求，且杂交瘤产生的免疫球蛋白的类型受亲代细胞特性的强烈影响，因此获得的杂交瘤分泌的抗体类型单一。影响融合效率的另一个重要因素是融合方法，传统的PEG融合法操作简单、成本低，但是效率低下；电融合是最适合产生杂交瘤的方式，但是电融合易导至大量的细胞死亡。 目前人类杂交瘤技术的相关方法存在着融合效率低、亚克隆易丢失、工作量大、抗体产量低等缺陷，应用于人类抗体的产生极为困难，无法成为挖掘人类抗体库的首选方法。 2.2 病毒感染维持增殖细胞中端粒稳态端粒是保持染色体的完整性和控制细胞分裂周期的重要结构，端粒维持机制可以抵消DNA复制过程中端粒缩短以及由此引发的DNA损伤反应、细胞周期停滞和凋亡，EBV基于端粒维持机制的激活而使宿主细胞永生化。在EBV诱导B细胞永生化的早期和晚期，端粒酶依赖和非依赖的端粒维持通路在感染细胞中都被激活。利用EBV转化的方法，研究者已成功获得了鉴定识别HIV、H1N1流感病毒、H5N1流感病毒、RSV、SARS-CoV和DENV的人类中和单抗。此外，有研究报道在未发生淋巴瘤的HBV慢性感染患者的PBMC中建立了具有无限增殖潜力的B细胞，另有研究发现SV40可有效感染人B细胞并明显延长其体外存活时间(观察至100天)，这些则提示了SV40、HBV感染可能成为转化B细胞永生化的潜在方法。 病毒一般仅感染特定的宿主细胞，使用EBV介导的B细胞永生化效率低，需要筛选大量的B细胞以获得具有所需特异性的非常罕见的B细胞克隆，且B细胞的长期生长和永生化可能与染色体畸变有关，细胞在基因突变过程中往往伴随细胞表型的改变，如发生肿瘤细胞转化、细胞生长停滞，抑或是传代过程中表现出染色体的不稳定性，这均导至难以进行B细胞单克隆化筛选。不仅如此，用于生成体内应用抗体的细胞不能含EBV和其他人类病毒，基于病毒转化的人类抗体的分离纯化难度更高。