荧光发射和荧光寿命 [Lifetime] 的工作原理

荧光分析和成像技术因具有非常高的灵敏度和分子特异性而广泛的应用于生物物理、生物化学、医学、物理、化学等领域，利用荧光光谱技术和荧光显微技术可以分析样品中荧光团的组分和分布。不过，由于荧光分析技术大多是基于荧光强度的测量，容易受到激发光强度、样品浓度淬灭、荧光染料的分布浓度等因素的影响，因此，其很难对样品做定量测量。 荧光寿命通常来讲是绝对的，不受激发光强度、荧光团浓度等因素的影响，仅仅与荧光团所处的微环境有关，因此，利用荧光寿命显微镜（Fluorescence lifetime imaging microscopy, FLIM）对样品进行荧光寿命成像，可以对样品所在的微环境中的许多物理参数如氧压、溶液疏水性等及生物化学参数如pH值、离子浓度等进行定量测量[1, 2]。此外，荧光寿命成像技术还可以同时获得分子状态和空间分布的信息。 荧光是分子吸收能量后，基态电子被激发到单线激发态后从第一单线激发态回到基态时所产生的，而荧光寿命是指分子在单线激发态平均停留的时间。分子吸收光后去激活的过程如下图1 Perrin-Jablonski能级示意图所示。分子中处于单线态的基态电子能级S0上的电子，根据Frank-Condon规则吸收某一波长的光子后，被激发到单线态的激发态电子能级S1中的某一个振动能级上，这个过程的时间约为10^-15 s；经过短暂的振动驰豫过程后（时间约10^-12~10^-10 s），S1态的最低振动能级上会积累大量的电子。这一状态的电子有几种释放能量，回到基态S0能级的途径，包括振动驰豫在内的这些途径被统称为去活化的过程。如果能量释放的过程中，伴随有光子的产生，那么称这种方式为辐射去活；如果通过碰撞等途径释放能量，没有光子的产生，那么称这种方式为无辐射去活。  

图1 Perrin-Jablonski能级示意图

荧光发射是一种较为常见的辐射去活过程，其通常指电子从S1态向S0态的跃迁，且同时向外产生光子的过程，这个过程的时间通常在10^-10~10^-7 s。利用光学仪器检测荧光发射的强度随时间的变化，就可以得到体系的荧光信息。 无辐射去活过程有如下几种途径： 1、内转换 内转换指的是电子在具有相同多重度的电子能级之间发生跃迁的过程，时间通常在10^-11到10^-9。 2、系间跨越  系间跨越指电子在不同多重度的能级间发生跃迁的过程，比如单线态S1向三线态T1的跃迁，时间通常在10^-10~10^-8。 3、荧光淬灭  荧光淬灭是指激发分子通过分子间的相互作用和能量转换而释放能量的过程，也称作外转换。

以上无辐射去活过程在决定体系的荧光寿命时起到非常重要的作用。此外，电子跃迁到T1态后，也会有一定几率以释放光子的形式跃迁至S0态，这称作磷光发射；或者再次系间跨越回S1态，并释放一个光子后回到S0态，这称作延迟荧光。

荧光寿命 在激发光源的照射下，一个荧光体系向各个方向发出荧光，当光源停止照射后，荧光不会立即消失，而是会逐渐衰减到零。荧光寿命是指分子受到光脉冲激发后返回到基态之前，在激发态的平均停留时间。处于激发态的荧光分子在退激发到基态的过程中发射荧光释放能量，激发态荧光团荧光强度的衰减用数学式可表达为单指数函数[3]:

         （1）

其中，I(t)是样品受到光脉冲激发后t时刻测量到的强度；I0是t=0时的强度；τ是平均荧光寿命且为分子的特征值，定义为荧光强度衰减到初始值I0的1/e（37%）时所需要的时间。实际上，由于荧光的发射是一个统计的过程，很少有荧光分子恰好在τ（荧光寿命）时刻发射荧光，因此，荧光寿命仅反映荧光强度衰减到其起始值1/e所需要的时间。此外，用仪器观察到的荧光寿命τ与激发态S1的寿命等价，不仅会受到荧光发射速率的影响，还会受到各种非辐射过程的影响，因此，用仪器直接测量到的表观荧光寿命也称作自然寿命。 对于复杂的荧光体系，由于各种荧光物质的性质或所处微观环境的不同，整个体系的荧光衰减曲线是多个指数衰减函数的加和，这称为多指数衰减：

       （2）

荧光寿命的测量方法主要有时域法和频域法[4]。时域法也叫作脉冲法，用超短光脉冲激发样品，测量样品在受到光脉冲激发后荧光强度的衰减规律如公式1，然后根据测量到的样品中各点的荧光强度衰减曲线进行拟合分析并计算荧光寿命值。比较简单的一种情况是单组分的荧光寿命测量，这时只需要在样品受到超短光脉冲激发后，在两个不同的时刻分别测量荧光强度的衰减，然后再利用如下的公式计算样品的荧光寿命。

         （3）

其中，I1和I2分别是样品在受到超短光脉冲激发后，在t1和t2时刻分别测量到的荧光强度。

下图图2是时域法荧光寿命测量的示意图。时域法荧光寿命的测量和荧光寿命成像主要有时间相关单光子计数法（time correlated single photon counting, TCSPC）、门控探测法（time-gated detection）、条纹相机测量法（streak-FLIM）、频闪技术等四种常见的方法。下面将分别简要介绍各测量技术的工作原理。

图2 时域法荧光寿命测量示意图

时间相关单光子计数法（TCSPC）[5,6] TCSPC是目前测量荧光寿命的主要技术，最早在1975年由PTI（Photon Technology International）公司首先商品化。TCSPC的工作原理如下图图3所示。同轴脉冲光源发出的脉冲光引起起始光电倍增管产生电信号，该信号通过恒分信号甄别器1启动时幅转换器（time-amplitude converter，TAC），时幅转换器产生一个随时间线性增长的电压信号。此外，同轴脉冲光源发出的脉冲光通过激发单色器后到达样品池，样品产生的荧光信号再经过发射单色器到达终止光电倍增管，由此产生的电信号经由恒分信号甄别器2到达时幅转换器并使其停止工作。此时，时幅转换器根据累积电压输出一个数字信号并在多通道分析仪（multi-channel analyzer）的相应时间通道计入一个信号，表明检测到寿命为该时间的一个光子。经过几十万次的重复后，不同的时间通道累积下来的光子数目不相同。以光子数对时间做图可以得到如下图图4所示的直方图，然后经过拟合和平滑处理后得到荧光衰减曲线。

图3 TCSPC测量荧光寿命的工作原理图

图4 TCSPC荧光衰减曲线形成的示意图

在使用TCSPC测量荧光寿命的过程中，需要调节样品的荧光强度，确保每次激发后最多只有一个荧光光子到达终止光电倍增管。TCSPC方法的突出优点是灵敏度高、测量结果准确、系统误差小。采用该技术对样品进行荧光寿命成像时，必须逐点测量样品的荧光寿命，而每一点的测量时间又比较长，因此，通常认为该技术不太适合荧光寿命测量。不过，近年来，随着TCSPC技术和固体超快激光技术的发展，TCSPC技术已具备快速测量荧光寿命的条件。通过与激光共聚焦显微镜的结合，可以对样品进行荧光寿命成像的测量。

门控探测法（time-gated detection） 门控探测法适用于单组分荧光强度衰减的测量和荧光寿命成像。荧光寿命可通过在两个不同延迟时刻开启的相同宽度的门内记录的荧光强度信息求得，如下图图5所示。通常情形下，在条件允许的情况下，采用多门控探测，即选取多个窗口获取多幅图像（通常为5~10幅）来反演寿命图像[7]。一般使用门控微通道板像增强器（MCP Intensifier）或者增强型CCD（Intensified CCD）相机，实现样品的宽场（full-field）荧光寿命成像。通过在样品受到超短光脉冲激发后的不同时刻（时间窗口）选通像增强器或CCD相机，获得一组荧光强度图像，然后利用公式（2）或者（1），逐点计算出样品上各点的荧光寿命并成像。

图5 门控探测法计算荧光寿命的示意图

门控探测法的光子使用率和时间分辨率受到探测器性能如脉冲响应特性的限制，另外，由于这种宽场成像方式一般是单光子激发，因此无法消除散射光和背景荧光的影响，成像的对比度和信噪比很低。不过，该实验装置实现简单，成像速度快。

典型的门控荧光寿命成像系统如下图图6所示。

图6 典型门控荧光寿命成像系统组成图

荧光寿命成像装置通常由激发光源、光电探测器、延迟仪器及图像处理设备组成。门控仪器的光源通常为短脉冲的超快激光器，常见的成像设备是CCD，延迟仪器提供FLIM的控制信号[8]。由于光电探测器和CCD等器件输出的是光强度信息，荧光寿命图像可以通过Rapid Lifetime Determination （RLD）和Weighted Nonlinear Least Square （WNLLS）[9]两种处理方法利用荧光强度图像通过反演得出。

条纹相机测量法（streak-FLIM） 条纹相机是一种具有非常高时间分辨率（