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摘要：
研究背景： 炎症性肠病（IBD）是指一系列肠道炎症相关疾病，包括溃疡性结肠炎（UC）和克罗恩病（CD）。其中UC的主要表现是结肠和直肠的慢性非特异性炎症，可涉及结肠和直肠的任何位置，一般从直肠黏膜炎症开始，并持续向结肠近端延伸。目前，UC的发病机制尚不清晰，但是越来越多的研究表明，UC的发生是多因素导致的，这其中主要包括遗传易感性、上皮屏障缺陷、免疫反应失调和环境因素等。而随着UC病程的发展，多数患者甚至可能会出现肠穿孔、中毒性巨结肠、癌变等危及生命的并发症。因此，针对UC开发相应的特效药物是目前研究的重要方向。迄今为止，对UC的治疗方式主要是药物治疗，然而，现在应用于临床的药物有时发挥的药效有限，并且有可能引起严重的副作用。 目前的临床数据表明，各个年龄段以及性别均有UC的发病，而且其发病率呈逐年上升趋势。在过去30年间，我国UC的发病率随着人民生活水平的提高也逐年升高，而UC作为一种慢性非特异性肠道炎症，具有反复发作、迁延不愈等特点。因此，针对我国目前UC的发病现状，及早开展相关药物和治疗策略的研究是未来研究的重点。天然产物作为一种重要的天然药物资源库，其中含有的生物活性物质能够对多种疾病产生治疗功效。而且天然产物本身具有结构新颖、副作用小等优点，其获取方法也相对简便、经济等，因此，从天然产物中筛选出缓解UC的药物具有良好的应用前景。 基于以上观点，找到一种新的可以有效控制UC且毒副作用小的天然药物具有重要意义。在本研究前期工作中利用RAW264.7细胞模型对几种天然产物（白果内酯、马钱苷、人参三醇）进行筛选，通过qRT-PCR实验检测促炎细胞因子的变化，结果发现所选的药物均对脂多糖（LPS）诱导的炎症有效果，但综合考虑药效、药物副作用以及经济性等因素，最终选择天然产物白果内酯作为缓解UC的研究对象。 研究目的： 探究天然产物白果内酯抑制UC炎症反应的机制，明确白果内酯是否可以通过保护肠上皮屏障及调节肠道菌群的稳态对UC起到治疗作用。 实验方法： （1）天然产物的筛选：采用qRT-PCR技术检测天然产物（白果内酯、马钱苷、人参三醇）对LPS诱导的相关促炎细胞因子的影响。 （2）体内实验：首先利用葡聚糖硫酸钠（DSS）诱导小鼠UC模型，造模的同时给予白果内酯保护治疗，造模结束后收集小鼠结肠组织及粪便，评估结肠长度、组织学特征等指标。其次对收集的结肠组织进行研磨，收集上清并提取组织蛋白，利用ELISA技术检测上清中促炎细胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α的表达，并采用WesternBlot对MAPK和AKT/NF-κB通路蛋白进行检测。此外，利用免疫荧光和WesternBlot方法对小鼠肠道组织中与肠屏障完整性相关的紧密连接蛋白ZO-1、Occludin和Claudin-3进行了检验。最后，对收集的小鼠粪便进行16SrDNA高通量测序分析，检验白果内酯对肠道菌群的影响。 （3）体外实验：首先采用LPS对RAW264.7细胞和MC38细胞诱导炎症，同时给予白果内酯保护。按RAW264.7细胞分组提取RNA进行qRT-PCR实验，检验iNOS、COX-2、IL-1β、IL-6和TNF-α等炎症因子的表达变化。然后提取细胞蛋白，利用WesternBlot方法对MAPK和AKT/NF-κB通路蛋白进行检测。此外，还利用免疫荧光和WesternBlot方法MC38细胞中紧密连接蛋白的表达进行了验证。 实验结果： 在天然产物筛选实验中，发现白果内酯与马钱苷和人参三醇相比，对促炎细胞因子的抑制作用最好，并且与治疗UC的常用药物5-氨基水杨酸相比没有明显的差异，因此选用白果内酯进行后续实验。 在动物实验中，发现与DSS处理的UC模型组小鼠相比，加入白果内酯处理的小鼠结肠长度增加、结肠组织学特征趋于正常化，并且白果内酯可以下调MPO以及促炎细胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α的表达。加入白果内酯的分组与DSS组相比，MAPK和AKT/NF-κB信号通路的激活被抑制，炎症表现减轻。此外，白果内酯能够上调ZO-1、Occludin和Claudin-3这些紧密连接蛋白的表达，保护肠上皮屏障的完整性。最后通过对小鼠粪便的测序分析，发现白果内酯可以影响肠道菌群的总体丰富度，促进益生菌种类（包括乳酸杆菌）的增殖，增强有益代谢，维持肠道菌群的稳态，从而达到缓解UC的作用。 在细胞水平上，与体内水平的研究一致，白果内酯可以缓解并保护RAW264.7细胞对抗LPS诱导的炎症损伤，可以有效降低相关炎症细胞因子的表达，从而达到抑制炎症的作用。并且与体内实验结果一致，白果内酯可以抑制LPS诱导的RAW264.7细胞中MAPK和AKT/NF-κB信号通路的激活。此外，在MC38细胞中验证了白果内酯对肠上皮屏障的影响，证明白果内酯可以增加炎症反应后细胞间紧密连接蛋白的表达。 结论： 综上所述，本实验初步从部分抗炎天然产物中筛选出白果内酯作为后续研究对象，并且发现白果内酯能够通过抑制MAPK和AKT/NF-κB信号通路缓解DSS诱导的小鼠结肠炎及LPS诱导的细胞炎症。同时，白果内酯还能够改善DSS和LPS破坏的肠上皮屏障，维持肠上皮屏障的完整性；并且白果内酯能够改善肠道菌群，重塑菌群构成，促进益生菌的定植，从而起到改善UC的作用。
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