环境雌激素影响斑马鱼生殖系统发育机制的初步研究

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作者：

胡晶莹

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摘要：

环境内分泌干扰物(Endocrine disrupting chemicals,EDCs)是干扰生物内分泌系统功能,特别影响生殖功能的人工或天然化合物。环境雌激素(Environmentalestrogens,EEs)是EDCs中对生物影响最严重的一种,能模拟体内天然雌激素并干扰其功能的人工合成的或植物化合物。实验证明这些物质导致动物和人类的生殖功能受损和干扰性别分化。17α-炔雌醇(17α-ethynylestradiol,EE2)是一种常见的EEs,是口服避孕药的主要成分,通过城市污水处理系统进入自然水环境。在自然水环境中,EE2的浓度可达42 ng/L。文献报道约5.7%的美国河流中含有EE2且浓度超过5 ng/l。由于EE2具有半衰期长和生物富集等特点,鱼体内EE2的含量可比自然环境中高数百至上千倍。鱼类暴露于EE2污染的水环境中引起本不表达卵黄蛋白原(Vitellogenin,VTG)的雄鱼和幼鱼表达VTG并引起性分化异常,雄性个体雌性化和生殖功能异常。 鉴于环境雌激素广泛存在与严重危害,我们以斑马鱼为模式生物研究环境雌激素对生殖系统的影响,首先利用环境雌激素诱导VTG表达这一特性,克隆VTG的转录调节区域,构建了对雌激素敏感的可用于直观检测环境雌激素的ere-zvtg1:egfp转基因斑马鱼系,并对该鱼系对雌激素的敏感性和特异性进行了研究,并探讨其实际应用价值。 实验室前期工作对环境雌激素影响斑马鱼生殖系统形态的发育及功能做出了详细的研究,本课题对环境雌激素影响斑马鱼生殖系统发育的三条可能途径进行了初步实验研究。 环境雌激素通过与斑马鱼体内雌激素受体结合,并结合在vtg启动子上游雌激素反应元件上,激活启动子进行转录mRNA,表达卵黄蛋白原蛋白。为了解雌激素受体在外源性雌激素诱导斑马鱼表达卵黄蛋白原基因并进一步干扰斑马鱼性腺发育中的作用,我们通过雌激素受体的功能抑制或下调其表达等方法观察雌激素受体在外源性环境雌激素诱导VTG表达中的作用,实验和统计表明外源性雌激素作用于斑马鱼的靶点是雌激素受体2b。 文献报道EDCs干扰斑马鱼胚胎原始生殖细胞(primordial germ cells,PGCs)的迁移和分布,对斑马鱼的生殖腺发育造成不利影响。为了研究EEs对斑马鱼原始生殖细胞迁移的影响,我们用绿色荧光蛋白特异的标记斑马鱼原始生殖细胞,用环境雌激素进行处理,结果表明EE2浓度达1ug/L时斑马鱼胚胎原始生殖细胞迁移开始出现异常,这一过程中需要斑马鱼雌激素受体2a参与。 环境内分泌干扰物可以诱发表观遗传学改变,涉及表观遗传中重要的lsd1基因,lsd1编码一种作用于H3K4(histon3 lysine4)的组蛋白脱甲基化酶,H3K4的二甲基化是稳定的表观遗传学印记,在线虫中lsd1基因缺失改变这种表观遗传印记,逐代积累导致线虫的不育。在哺乳动物的睾丸中lsd1含量明显高于其他组织,提示lsd1与精子的形成相关。环境雌激素使斑马鱼精子的产生及精子质量严重下降,甚至引起不孕不育。lsd1基因表达改变与环境雌激素都可以导致生殖异常,这两种因素是否有交叉作用呢?我们拟用人工锌指核酸酶技术对lsd1基因进行特异性基因打靶,构建lsd1基因缺失斑马鱼系,深入研究lsd1基因的功能,目前已经构建成功lsd1-人工锌指核酸酶载体,并证明lsd1-ZFN能在斑马鱼中表达,后续筛选试验正在进行中。

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关键词：

斑马鱼 环境雌激素 生殖系统 发育机制