奶牛乳腺健康与乳中体细胞数之间关系的研究进展

乳腺炎是全球乳业最流行、造成经济损失最大的疾病之一，如果能在乳腺炎之前更早地发现乳腺内感染，并进行隔离、治疗等相应措施，将极大地减少牛场经济损失。乳中体细胞数(somatic cell count，SCC)升高是乳腺内感染、乳腺损伤的结果，会影响奶牛的泌乳性能[1]，同时乳中和血液中免疫相关蛋白和细胞因子会发生相应的变化[2-4]。虽然SCC能在一定程度上反映乳腺的健康状况，但很多研究发现仅仅通过SCC来判断乳腺健康是不严格的，存在一定的局限性[5-7]。目前，国内外已有诸多报道提出了新指标体细胞分型指数(differential somatic cell count，DSCC)，表明其可以作为SCC的附加指标来监测奶牛乳腺内感染情况，能在低SCC的奶牛中检测出处于炎症早期的奶牛，揭示发病奶牛处于炎症的何种阶段，并且可以反映奶牛的乳腺健康及泌乳性能的状态[8-10]。本文围绕以上主题，结合国内外近年来的研究成果进行综述。

乳腺炎是乳腺组织发生的一种炎症反应，表现为牛乳成分异常、产奶量下降等问题。诱发因素较多，主要包括病原微生物侵袭、营养不良、环境不适、挤奶方式不当等，但细菌感染是造成乳腺炎的最主要病因[1]。传染性病原菌(包括无乳链球菌、金黄色葡萄球菌、牛棒状杆菌等)是检出率最高的病原菌，引起奶牛临床型乳腺炎和隐型乳腺炎。环境型病原菌(包括乳腺链球菌、埃希氏大肠杆菌、变形杆菌等)通常引起临床型乳腺炎[11]。机会型病原菌如凝固酶阴性葡萄球菌(CNS)通常引起隐型乳腺炎。由于隐型乳腺炎给奶牛泌乳带来不利影响的同时，不易被发现且具有传染性，对牛场造成的经济损失更为严重。

牛乳中的SCC指每毫升牛乳中的总细胞数，多数是免疫细胞(即巨噬细胞、嗜中性粒细胞和淋巴细胞)，约占SCC的99%；乳腺组织脱落的上皮细胞约占1%[12]。当奶牛发生乳腺内感染(intramammary infection，IMI)，乳中SCC升高，尤其是白细胞数目明显增长，原因是细菌及其代谢物诱导嗜中性粒细胞(PMN)进入乳腺[13]。因此，乳中SCC能很好地反映奶牛乳腺的健康状况和乳品质，正常情况下牛乳中的SCC小于20万个/mL，而当乳腺有外伤或者发生乳腺炎时SCC会超过20万个/mL[14]。有研究表明，引起SCC变化的因素很多，随着奶牛年龄及胎次的增加，SCC有升高的趋势[15]。可能的原因有多种，老龄奶牛的乳头管更容易发生损伤，愈合更慢，增加了细菌侵入的机会，且其免疫机能下降，清除病原菌的效率降低。此外，产犊初期奶牛乳中的SCC也显著升高，这是因为此时机体免疫力较低，病原菌容易入侵并增殖[16]。夏季的SCC在1年内最高，因为夏季细菌最活跃，奶牛出现热应激的情况也增多，导致乳腺炎的发病率增加。研究发现，泌乳末期的奶牛SCC也增高，这是产奶量降低产生的结果，但不患隐型乳腺炎的奶牛这种现象不明显[15]。虽然引起SCC升高的原因有很多，但最主要的因素是乳腺炎的发生。因此，对于肉眼无法判别病症的奶牛，可以检测SCC判断其是否患有隐型乳腺炎。

当乳腺内感染发生后，病原菌增殖使乳腺上皮细胞开始损伤，若感染持续存在，乳腺内SCC不断增加导致乳腺组织损伤恶化，最终腺体中腺泡完整结构被破坏，血乳屏障受损，产生炎症反应[17]。因此，SCC升高早于乳腺炎的发生，这是乳腺健康状态受损，机体启动免疫反应的结果，并且会影响奶牛的泌乳性能。所以，检测牛乳中的SCC来判断乳腺健康状况具有一定的指示性。

健康牛乳中SCC应小于20万个/mL，当乳腺发生感染时，最重要的表现就是SCC发生不同程度的升高，引起奶牛泌乳性能的变化，主要包括奶牛的产奶量、牛乳中乳蛋白率、乳糖率和乳脂率的变化等[18-19]。目前，关于乳中SCC与产奶量及乳成分的相关性研究得到了广泛关注，SCC可作为表型特征指示乳品质量，其升高通常是因为乳腺内已经发生了感染，感染区PMN数剧烈增长；若感染未及时消除，则会导致乳腺炎的发生，SCC进而持续升高[20]。Costa等[21]对意大利地区大规模牛场的奶牛数据进行统计，发现SCC逐渐升高的情况下，产奶量和乳糖含量显著降低，但对乳脂率和乳蛋白率无显著影响。祝语等[22]对昆明地区某牛场3 000头奶牛的生产性能测定(dairy herd improvement，DHI)数据进行相关分析发现，SCC与乳蛋白率呈极显著正相关，与乳糖含量呈极显著负相关，但不同SCC组间乳脂率差异不显著。韩丽云等[23]将宁夏地区325头荷斯坦奶牛SCC数据转化为体细胞评分(SCS)，发现乳中SCS与日产奶量呈显著负相关，与乳糖含量呈正相关，但与乳脂率无显著相关性。田悦珍等[24]对新疆2个牛场1 500余条DHI数据分析发现，随着新疆褐牛乳中SCC增加，产奶量、乳糖率和乳脂率均下降。

以上各地区对奶牛SCC与泌乳性能相关分析表明，乳中SCC的升高通常造成：1)产奶量下降[23-24]。因为高SCC的奶牛大多是由于乳腺内病原菌增多，这些细菌分泌毒素，造成乳腺上皮细胞损伤等，进而导致了产奶量下降。也有特殊情况，如CNS引发的乳腺早期感染，导致SCC升高的同时不会造成产奶量的下降[25]。2)乳蛋白率升高[22-23]。由于SCC的升高伴有血-乳屏障的渗透性增加，使得血液中的免疫球蛋白、乳铁蛋白、白蛋白等流入乳中，从而导致了乳蛋白率的升高[26]。然而，这种牛乳中增加的乳蛋白通常是乳清蛋白和一些免疫蛋白，相反，对人体有益的酪蛋白显著减少[27]，可能是因为活化素和肿瘤生长因子-β抑制了信号转导和转录激活因子5(STAT5)反式激活和STAT5介导的转录，从而导致酪蛋白含量的下降[28]。因此这种乳蛋白率的增加对乳品质是有害的。3)乳糖率下降[22-24]。当SCC高时会强烈刺激奶牛机体发生免疫反应，造成奶牛精神不振，食欲不佳，饲粮摄入营养不足，从而在乳糖合成时D-半乳糖和D-葡萄糖供应不足，导致乳糖合成量下降[23]。同时，高SCC的奶牛乳腺组织损伤，毛细血管破裂，血液渗透进入乳中，导致血-乳之间的渗透压降低，从而降低了乳糖向牛乳中的渗透[29]，并且乳腺上皮细胞的载体破损，导致乳糖的流失。4)对于乳脂率变化尚未有统一的定论。理论上SCC升高常常伴随乳脂合成和分泌降低，并且使乳中含有大量游离脂肪酸，牛乳中会出现脂肪氧化，具有苦、涩等不良气味[23]。有研究报道，随着SCC的升高，乳脂率应呈现下降趋势，但由于产奶量的减少，乳脂总量减少与浓缩效应产生抵消，故而各项研究中乳脂率差异不同[23-24]。

目前研究表明，当牛乳SCC变化时，乳汁或者血液中相关酶类物质、免疫球蛋白、急性期蛋白及细胞因子等含量或活性也随之发生变化[2]。程艳艳等[3]发现高SCC组奶牛的血液和乳汁中的丙二醛(MDA)含量显著高于低SCC组，而超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性随着SCC的升高有递减的趋势。伊柏双等[4]也发现了高SCC且已经发生乳腺炎的奶牛，血清中SOD、GSH-Px、过氧化氢酶(CAT)活性显著低于健康奶牛，说明奶牛SCC越高，炎症反应越严重，其抗氧化能力越差，这些指标可作为判定乳腺感染的依据。据报道，乳腺内起抗菌作用的免疫球蛋白(Ig)主要包括IgG1、IgG2、IgA和IgM[4]。其中IgG1、IgG2、IgM可作为调理素提高PMN和巨噬细胞的吞噬作用；而IgA主要通过凝聚入侵的细菌防止其在乳腺内扩散[30]。正常乳汁中的IgG1含量最高，细菌感染导致高SCC乳汁中免疫球蛋白含量增加，但不同病原菌感染引起的Ig含量变化有差异[4]。乳汁中IgG1、IgG2含量的增加可能是由大肠埃希氏杆菌毒力成分脂多糖(LPS)诱导，而乳汁中只有IgG2含量增加，IgG1含量不变则有可能是金黄色葡萄球菌毒力成分脂磷壁酸(LTA)诱导发生的[2]。

据报道，SCC与急性期蛋白、免疫相关蛋白及免疫因子有密切关系[31-33]。沈维军等[19]在对高SCC牛乳蛋白成分的研究中发现，高SCC牛奶中增加的蛋白为急性期蛋白(如白蛋白、结合珠蛋白和α1酸性蛋白)和免疫相关蛋白(如转铁蛋白、乳铁蛋白抗菌肽1和IgG等)。白蛋白在血浆中含量较高，血乳屏障受损后导致其流入牛乳。结合珠蛋白和α1酸性糖蛋白通常在肝内合成，PMN和乳腺细胞也可合成，乳腺炎刚开始时，可以观察到这2种蛋白含量的迅速增加[31-32]。抗菌肽具有高抗菌活性，在机体自然免疫中发挥作用。因此，高SCC的牛乳中抗菌肽1含量的增加可能是机体启动免疫反应、对抗感染的表现[33]。当乳腺刚感染时，乳腺上皮细胞释放趋化因子白细胞介素-8(IL-8)，使PMN迁移到乳腺中造成SCC快速增长。PMN释放炎性细胞因子[肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1(IL-1)、白细胞介素-12(IL-12)和趋化因子IL-8]，促进急性期炎症反应，从而发挥相关的免疫功能，进而加强对病原菌的有效清除[17]。若是持续、慢性的炎症，SCC不断增加的同时，造成临床型乳腺炎，则奶牛血清中IL-1β、IL-8和TNF-α的含量升高，但造成隐型乳腺炎的血清中这些细胞因子的差异不显著[17, 34]。

国际乳业联合会建议同时使用乳中SCC和细菌学分析来确定乳腺健康[35]。因此，奶牛乳腺是否感染应该以细菌学检测作为参考标准(国际乳腺委员会，2004)。尽管如此，一些已感染乳腺炎的奶牛并未出现SCC增加，但细菌学分析呈假阴性结果[5]。特别是对于凝固酶阴性葡萄球菌，这种细菌可能是引发早期乳腺炎的潜在致病病原体，会造成SCC升高，但对奶牛生产性能无不利影响；有时它们只存在于乳头皮肤上，会导致样本的细菌学检测呈假阳性结果，其实并非乳腺内感染[25]，那么对感染乳区的识别仍然存在困难。

乳中SCC判断乳腺炎的发生，存在一定的局限性。在Schwarz等[5]对德国某牛群乳腺炎的研究中，对乳腺健康的标准很高，将区分乳腺是否感染的阈值确定为100 000个/mL。然而，即使在SCC≤100 000个/mL的乳汁中，出乎意料地检测到了高数量的病原体。甚至在一些SCC为1 000个/mL左右的样本中也检测出主要病原体(金黄色葡萄球菌及无乳链球菌)和次要病原体(CNS及棒状杆菌属)，这使作者怀疑SCC为100 000个/mL的阈值无法判断乳腺是否已经产生炎症反应。汪悦等[25]在奶牛SCC研究中发现，在SCC＜100 000个/mL时，乳腺内早期炎症可能已经出现。然而有小部分样品平均SCC＞300 000个/mL，远超过100 000个/mL的阈值，但其细菌学检查结果呈阴性未感染。总而言之，在一些低SCC的奶牛乳腺中，实际可能已经发生了感染，但此时乳腺内以PMN的大量聚集为主，还不能检测到SCC的显著升高[6]；并且当某些细菌如金黄色葡萄球菌，感染乳腺后会释放一种杀白细胞素，导致感染后SCC也不会明显上升[7]。一些高SCC奶牛，甚至达到SCC＞40万个/mL，但此时其乳腺内病原菌已经被清除了，处于痊愈过程中，是由于炎症反应依然活跃造成的高SCC[25]。因此，SCC计数虽是一种比较可靠的指示乳腺炎的指标，然而不能准确地判断乳腺是否发生感染，也不能将牛奶中存在的体细胞区分为不同的类型[6]，仅仅依赖乳中SCC来判断乳腺感染的情况是不严格的。

在乳腺中，免疫细胞(主要为淋巴细胞、巨噬细胞和PMN)的数量和分布可以反映炎症反应的进程[6]。随着炎症的发展，各种免疫细胞反应不同，只应用SCC来指示炎症的发生，存在局限性[36]。已有多项研究[8, 10, 36-38]表明，DSCC有利于更明确地描述奶牛乳腺健康的实际情况，可以将PMN、淋巴细胞和巨噬细胞作为一个整体，DSCC代表PMN和淋巴细胞占整体的比例之和，巨噬细胞用100%减去DSCC得到[8]，这可以显示不同细胞比例的变化并揭示炎症反应正处于哪个阶段，即使在SCC为1 000个/mL的样本中，仍具有较好的指示效果[35]。Pillai等[9]在研究炎性细胞时发现，体细胞计数和PMN计数呈正相关关系，SCC较多的乳区其PMN数也比较高，并且相对于3次细菌学检测阴性的乳区(PMN比例为17%~25%)，3次细菌学检测阳性的乳区中PMN的比例更高(33%~59%)，这些均说明乳区发生感染后会导致SCC增加，并且很大一部分是由于PMN数的增加导致的。Schwarz等[28]研究发现，在极低SCC(＜6 250个/mL)的样本中，淋巴细胞的比例高达88%；在6 250个/mL＜SCC＜25 000个/mL的样本中，淋巴细胞也是主要的细胞群体；在9 000个/mL＜SCC＜46 000个/mL的41个样本中，已经有6个样本的DSCC图谱显示出高比例的PMN(56%~75%)。然而，据报道，在SCC＞100 000个/mL的15个病区乳样中，有13个样本以PMN为主要细胞群体[6]。这说明在极低SCC的样本中，若检测到高比例的PMN，则很有可能已经发生乳腺内感染。此外，Wall等[10]在脂多糖和脂磷壁酸诱导的乳腺炎症反应中，观察到乳腺炎早期高SCC和高DSCC，而治愈期DSCC显著下降；因此，提出了将高SCC(SCC≥20万个/mL)以及DSCC(DSCC＜86%或DSCC＞86%)，来判断乳腺炎处于早期或晚期进而指示健康状态。在SCC已知的情况下，附加DSCC能描述关于IMI状态的重要性息，但这取决于感染的病原体。Kirkeby等[36]对此作了进一步研究，发现对于已经感染主要病原体(金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、无乳链球菌等)的奶牛，附加DSCC可以显著改善对任一病原体的指征；对于“健康的”奶牛，附加DSCC也可以显著改善对次要病原菌(棒状杆菌、CNS等)的指示能力。

直到2017年，世界各地已经开发出了检测细胞分型的方法，但还没有高通量检测DSCC的常规方法。Damm等[8]利用FOSS DSCC法测定DSCC等参数，并与现有的成熟方法进行比较，验证了随着SCC的增加，PMN的比例增加，巨噬细胞的比例减少，而淋巴细胞数量在整个炎症过程中一直处于很低的状态。因此，DSCC反映了PMN和巨噬细胞的反比例关系，并且该方法特异性、准确性和稳定性都很强，且为低成本、可重复、快速、准确并同时检测单个牛乳样本中的DSCC和SCC提供了方法，增加了将DSCC添入DHI框架内的可能。近几年，有研究发现DSCC与乳品质存在显著的相关性[37-38]。Zecconi等[37]对意大利地区牛群分析结果表明，发现在SCC很低的奶牛中，随着DSCC增加，乳脂率、乳蛋白率特别是酪蛋白率显著降低，那么DSCC可作为低SCC奶牛乳成分变化的标志。Stcco等[38]对DSCC与乳品质进行了进一步分析，发现DSCC的变化对乳中的乳脂率和乳糖率影响最大，分别呈负相关和正相关关系，特别是在DSCC刚开始上升时，可作为判断这2种乳成分变化的依据。在高DSCC(DSCC≥78.5%)时，乳蛋白率和酪蛋白率显著下降，且此时SCC的变化也影响酪蛋白率。因此，附加DSCC指标可用于农场(减少抗菌剂的使用)到奶厂(进一步评估牛奶品质和价值)的多重监控。

乳中SCC是一项比较可靠的判断乳腺健康的指标，在我国已沿用多年，可粗略反映乳腺是否发生炎症，并在一定程度上指示奶牛的泌乳性能和乳腺的健康状态。若结合新参数DSCC可以更准确地监测乳腺健康，更早地发现感染奶牛，同时可以进一步判断乳品质量。但是，DSCC在DHI框架内的实际应用还需要进一步的探讨，乳腺感染的复杂性需要广泛的纵向研究。