免疫组化原理应用及流程

免疫组化

公共平台   李敏敬

一、  基本原理

免疫组化是利用抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂  (荧光素、酶、金属离子、同位素) 显色来确定组织细胞内抗原 (多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及定量的研究。根据标记物的不同分为：免疫酶法、免疫荧光法、亲和组织化学法、免疫铁蛋白法、免疫金法及放射免疫自影法等。其中前三种最常用。

二、     免疫组化的使用范围

组织或细胞中凡是能作为抗原或半抗原，如蛋白质、多肽、氨基酸、多糖、磷脂、受体、酶、激素、核酸及病原体等都可用相应的特异性抗体进行检测。最常用的是组织的石蜡切片、冰冻切片，再者就是活细胞爬片，将组织或细胞固定于载玻片上，进而进行以下实验。

三、     操作步骤

（一）组织处理：

1.  取新鲜组织厚度不超过5mm，10% 中性福尔马林固定，大于24小时。

2.  固定后冲水1-2小时，

3.  75%酒精，1次，1小时，

4.  85%酒精，1次，1小时，

5.  95%酒精，3次，1小时，

6.  100%酒精，3次，1小时，

7.  二甲苯，2次，1小时，

8.  石蜡浸泡，3次，2小时，

HE 染色：

{水化}

1.  二甲苯，2次，5-10分钟，

2.  100%酒精，1次，1-2  分钟，

3.  95%酒精，1次，1-2  分钟，

4.  85%酒精，1次，1-2  分钟，

5.  75%酒精，1次，1-2  分钟，

6.  过蒸馏水，

{染色}

1.  Mayer 氏苏木素，1  分钟，

2.  温水冲洗，5-10 分钟，

3.  75% 盐酸酒精，1-2  分钟，

4.  自来水冲洗，30  秒钟，

5.  依红复染，1-2  分钟，

6.  自来水洗，30  秒钟，

7.  85%酒精，1次，1-2  分钟，

8.  95%酒精，2次，1-2  分钟，

9.  100%酒精，2次，1-2  分钟，

10. 二甲苯，2次，5-10分钟，

11. 中性树胶封片。

（二）石蜡切片免疫组化染色实验步骤（三步法为例）：

A 石蜡切片：

1．石蜡切片脱蜡至水：（石蜡切片染色前应置60 1 ℃小时）。

（1）二甲苯Ι、II,各10分钟。

（2）梯度酒精水化：100%，2分钟→95%，2分钟→80%，2分钟→70%2分钟。

（3）蒸馏水洗：5分钟，2次（置于摇床）。

2．过氧化氢封闭内源性过氧化物酶：3% H2O2，室温10分钟（避光）。

3．蒸馏水洗：5分钟，2次（置于摇床）。

4．抗原修复：根据待检测的抗原，选择适当的方法。

附：抗原修复液（10mM pH 6.0枸橼酸钠缓冲液）的配制

（1）储备液的配制：

A液：枸橼酸三钠-2H2O 29.41g + 蒸馏水1000ml

B液：枸橼酸21g + 蒸馏水1000ml

（2）工作液的配制：A液82ml + B液18ml + 蒸馏水900ml

抗原修复的方法：

（1）高压锅处理技术：枸橼酸钠缓冲液（10mM，PH6.0）,淹没切片,盖上锅盖，高压锅内煮沸, 上汽3分钟后缓慢冷却（可用自来水在高压锅外冲，以助冷却）。

（2）微波处理技术:用塑料切片架,置于塑料或耐温玻璃容器内，枸橼酸钠缓冲液淹没切片，选择中高或高档,5分钟;取出并补充已预热的枸橼酸钠缓冲液；再选择中高或高档,5分钟.（最佳温度为92∼95℃）

（3）酶消化处理：此略。

抗原修复的注意事项：

（1）不能让组织干透。

（2）选择抗原修复方法要因抗体而异。

（3）该方法主要用于10%福尔马林固定、石蜡包埋组织。

（4）抗原修复后至DAB显色的过程中，均需用PBS缓冲液。

5．PBS：5分钟，2次（置于摇床）。

6．正常血清封闭：从染片缸中取出切片，擦净切片背面水分及切片正面组织周围的水分（保持组织呈湿润状态）,滴加正常山羊或兔血清（与第二抗体同源动物血清）处理，37℃，15分钟。

附：正常血清配制(或按试剂盒规定的浓度配制) 按1:20比例,用PBS配制,每张切片需要量按50µl+5µl (10%抛洒量)计算。

7．滴加第一抗体：用滤纸吸去封闭血清，不洗，直接滴加第一抗体，37 2 ℃2小时。（也可置于4℃冰箱过夜）。

8．PBS：5分钟，2次（置于摇床）。

9．滴加生物素化的二抗，37℃，40分钟。

10．PBS：5分钟，2次（置于摇床）。

11．滴加三抗（SAB复合物），37℃，40分钟。

12．PBS：5分钟，2次（置于摇床）。

13．DAB 显色，镜下观察，适时终止（自来水冲终止）。

附：DAB的配制

（1）储备液(DAB 25mg/ml)的配制：DAB 250mg + PBS 10ml，待完全溶解后分装成1ml,100µl,50µl，20µl等，—20℃，冻存。

（2）工作液：DAB 储备液20µl + PBS 1000µl + 3% H2O2  5µl

14．自来水（细水）充分冲洗。

15．苏木素复染，室温，30秒，自来水冲洗。

16．自来水冲洗返蓝，15分钟。

17．梯度酒精脱水：

80%，2分钟→95%，2分钟→100%，2次，5分钟。

18．二甲苯透明：

I，II（二甲苯）各5分钟

19．封片：加拿大树胶（或中性树胶）封片。

B 细胞爬片的免疫组化染色：

1.  取出细胞爬片，迅速置入冷丙酮固定20∼30分钟。

2.  蒸馏水浸泡5分钟，2次。

3.  打孔液浸泡5分钟。

4.  蒸馏水浸泡5分钟，2次。

5.  后接前述实验步骤的第6步（正常血清封闭）。

注：第3、4步仅用于检测细胞内抗原，检测细胞膜抗原时不用。

C 冰冻切片的免疫组化染色：

1.  新鲜组织立即在恒冷冰冻切片机内切片(也可添加OCT保存在-80℃，),厚度为5～6µm。

2.  载玻片可不打底，裱片后，立即用电吹风吹干。

3.  如不马上染色，可密封后-20℃保存。

4.  染色前用冷丙酮在4℃固定10-20分钟。

5.  PBS洗2次,每次5分钟,(必要时应用0.1%柠檬酸钠+0.1%triton打孔)

6.  3% H2O2灭活内源性过氧化物酶,20分钟,避光;

7.  用PBS 洗2次,每次5分钟;

8.  接前面实验步骤第六步.

D切片的预处理：

1.  洗衣粉液浸泡30分钟，冲洗，晾干。

2.  洗液（含强酸、高锰酸钾等）浸泡24小时，冲洗，晾干。

3.  APES（1:50 丙酮溶液）10-20秒（注意：不能用塑料容器及塑料切片架）。

4.  纯丙酮I，约10秒。纯丙酮II，约5秒

5.  晾干或烤箱内烤干，备用。

1、石蜡切片置于67℃烘箱中，烘片2小时，脱蜡至水，用pH7.4的PBS冲洗三次，每次3分钟（3×3’）。

2、取一定量pH=6.0柠檬酸盐缓冲液，加入微波盒中，微波加热至沸腾，将脱蜡水化后的组织切片置于耐高温塑料切片架上，放入已沸腾的缓冲液中，中档微波处理10分钟，取出微波盒流水自然泠却，从缓冲液中取出玻片，先用蒸馏水冲洗两次，之后用PBS冲洗2×3’。（注：不是所有的抗体都需要微波修复的，视具体情况而定）

3、每张切片加1滴3%H2O2，室温下孵育10分钟，以阻断内源性过氧化物酶的活性。PBS冲洗3×3’。

4、除去PBS液，每张切片加1滴相应的第一抗体（相应稀释倍数），室温下孵育2小时。（注：抗体的推荐稀释比例，做预实验，调整抗体的最佳稀释度，不影响效果，又可节约抗体用量。）

5、PBS冲洗3×5’。除去PBS液，每张切片加1滴聚合物增强剂（增强一抗二抗的结合度），室温下孵育20分钟。PBS冲洗3×3’。

6、除去PBS液，每张切片加1滴酶标抗鼠/兔聚合物（即二抗，若是荧光二抗注意避光操作），室温下孵育30分钟。PBS冲洗3×5’。

7、除去PBS液，每张切片加1滴新鲜配制的DAB液（二氨基联苯胺），显微镜下观察5分钟。

8、苏木素复染，0.1%HCl分化，自来水冲洗，蓝化，切片经梯度酒精脱水干燥，二甲苯透明，中性树胶封固，晾干后观察。

特点1.  在切片加上一抗后，第二抗体标记多聚螯合物酶（HRP）的复合物与一抗结合，在多聚螯合物上有大量的HRP分子，使抗原信号有显著的放大，其敏感性较SABC、SP法高。2.  由于多聚物在体内不存在，又不使用生物素，从而避免了由于生物素引起的非特异性背景染色，背景比SABC、SP法清晰。3.  辣根过氧化物酶与二抗结合在多聚物上，替代传统方法的二抗、三抗，减少了实验步骤，且试剂孵育时间短，只需15分钟，使得免疫组化方法更简单，实验时间比SABC、SP法大为缩短。

B细胞爬片：

1.取出细胞爬片放到35mm或60mm用过的细胞培养皿里，PBS洗三遍。 （注意：有的时候作的细胞爬片可能比较小，因此夹取的时候要小心，注意： 反正面，放在皿里洗比较方便，避免了来回夹取，另外洗的时候加PBS不要太冲，不要细胞冲下来。洗的时候多加PBS，稍晃一下就倒掉，三次即可。）

2. 4％冷的多聚甲醛固定20分钟，PBS洗三遍。

3. 0.2％Triton X－100通透10分钟，PBS洗三遍。 

4. 与二抗相同宿主的血清封闭30分钟，PBS洗三遍。

5. 一抗4度湿盒内过夜，也可37度2小时，感觉前者效果好，PBS洗三遍。

6.二抗室温2小时（荧光二抗要避光，避免荧光丢失），或者37度1半小时，PBS洗三遍。

7.最好用DAPI染核（作为参照），然后直接照荧光片。

8.蒸馏水洗掉PBS，甘油封片，指甲油封片子的四周，因为甘油不象树脂那样会干，所以不用指甲油封的话会弄的一塌糊涂。

注意事项：

1.染完之后没有封片前直接照一些，因为有的时候可能封片会出现问题，再想照反而没有了，另外不要拖太长时间，荧光会淬灭的。

2.荧光的片子一定要避光保存，保存的好的话，过一段时间仍然能照出很好的片子。

3.二抗用之前一定离心，不然有的时候有那种沉淀，在片子上就是一个很大的非特异性荧光光点，非常难看。

四、结果分析

A免疫组化实验结果的判定和分析

就实验结果而言，免疫组化技术服务主要涉及抗体实验结果的描述与分析、图片的确定与选取、相关数据的提供，上述工作是免疫组化工作的重点内容。只有严格的实验设计、标准的实验操作、专业化的结果分析才能满足客户的要求，更好地为客户提供最优质的服务。

B免疫组化结果的判定原则：

⒈必须同时设对照染色。没有对照染色的免疫组化染色结果是不可信的。

⒉抗原表达必须在特定部位。如LCA应定位在细胞膜上；CK应定位在细胞浆内；PCNA及p53蛋白应定位在细胞核内；EMA应定位在细胞膜上等等。不在抗原所在部位的阳性着色，一概不能视为阳性。

⒊阴性结果不能视为抗原不表达。由于检测方法灵敏度有高低之分，有时可因染色方法灵敏度不够，而导致阴性反应，判断时应注意。

⒋尽量避开出血、坏死及切片刀痕和界面边缘细胞的阳性表达，特别是酶免疫标记。因为这类阳性着色多系内源干扰，或系人为因素所致。

⒌对免疫组化标记结果的意义不能绝对化，应结合临床资料、X线等影像学及实验结果综合分析。

C对照染色设计：

(一）对照染色的目的

设对照的目的是为了排除假阴性和假阳性。假阴性的原因主要有三种：

① 组织处理不当，抗原丢失过多或被遮蔽；

② 抗体失活、效价过低或稀释度不合适（主要指一抗，即特异性抗体）；

③ 染色步骤遗漏及差错，或显色剂的选择、缓冲液pH和离子强度不当等。

假阳性均系由多种因素造成的非特异着色所致，原因主要有：

① 自发荧光或内源酶等干扰；

② 抗体试剂不纯(特别是一抗）；

③ 操作失误，如污染、切片干枯或显色剂操作不当等；

④ Fc受体的干扰，等等。

（二）对照的种类及其选用目的

对照染色大致可分为四类：即阳性组织对照、阴性组织和阴性试剂对照及自身对照。

⒈阳性组织对照

用已证实含有靶抗原的同源及不同源组织切片或细胞涂片与待检实验切片同时作同样处理和免疫染色的组织对照。正确的结果应呈现阳性，目的是为了证实所用免疫组化染色流程的有效性，排除假阴性的可能。

⒉阴性组织对照

指用已证实不含靶抗原的同步处理和免疫标记染色的组织对照。正确的结果应为阴性，目的是除外假阳性。

⒊阴性试剂对照

是指用于证实在免疫组化染色中所用试剂，尤其是特异性抗体试剂的有效性和可靠性而所设立的同步免疫染色对照，包括有：空白对照、替代对照、吸收试验和抑制试验等。目的在于除外假阳性和证实所用免疫组化试剂及其技术方法的有效性和待检实验切片免疫标记阳性结果的可靠性。

⑴ 空白对照

指以缓冲液（PBS、TBS等）取代第一抗体（主要的，必要时还可做第二抗体及桥联抗体的空白取代），其他各步不变的试剂对照染色，结果应为阴性。

⑵ 取代对照

指以所用方法第一抗体同源动物的正常血清，或与本实验无关的抗体(靶生物缺如的)取代第一抗体，其他步骤不变的试剂对照染色，结果应为阴性。

⑶ 吸收试验

是指用事先经过量抗原吸收的第一抗体上清液取代第一抗体，其他步骤不变的免疫染色试剂对照。结果应是阴性或阳性着色明显减弱（吸收不全时）。

⑷ 抑制试验

是指用标记抗体和未标记抗体（可以是一抗，也可以是二抗或桥抗体）两者的混合物作试剂，其他步骤不变的免疫组化染色试剂对照，结果其阳性着色应成比例的减弱（等量或1：9）。此试剂对照多用于直接法。

这类阴性试剂对照的选用原则是：

① 空白对照不能省，其他对照在预实验中应多做，尤其是应用新抗体试剂；

② 对照必需与实验片同步进行染色；

③ 对照的结果应附合要求。

⒋自身对照

是指在同一标记切片上的自身组织成分的阴性背景对照。即与靶抗原阳性反应细胞或成分相邻的阴性背景结构的显色，结果应为阴性或着色较浅，需与阳性着色成分呈鲜明对比。目的在于排除内源性干扰产生的假阳性和因抗原弥散移位造成的错误结果。

非特异性染色：

非特异染色是指免疫组化染色过程中产生的非靶抗原的呈色结果，属假阳性，又称背景着色，能严重干扰免疫组化染色结果的正确判断，应竭力避免或减轻。其原因涉及免疫组化染色流程的各个环节，可来自：

① 内源性干扰(自发荧光、内源酶、内源性生物素等)；

② 试剂污染(质量差，交叉反应，Fc受体干扰等)；

③ 组织处理不当(组织固定不及时或固定不良所导致的抗原弥散移位、洗涤不充分所导致的游离试剂残留等)。

纠正的方法视原因而异，可在预实验基础上，采用有针对性的纠正对策，即对症下药。

阳性标记的形态特征和判断：

免疫组化标记具有一定形态特点，若能熟练掌握则有助于对免疫组化标记结果的正确判断。特点包括定性、定位和定量三方面。

免疫显色强度和阳性细胞密度是定性定量指标，实际工作中常采用强度和密度结合的方法综合计量，与抗原含量有关；阳性细胞的着色形态及组织分布特点主要是定位指标，与功能有关。

一、阳性标记免疫特征

分"弱(+)、中(++)、强(+++)"三级。免疫荧光法（FITC为例）则表现为浅绿色荧光、明显绿色荧光和亮绿色耀眼荧光；

免疫酶标记（HRP- DAB/H2O2）则表现为淡黄色细颗粒、棕黄色颗粒和褐黄色粗颗粒，后者耀眼易见。一般图片照像，原则上多取强阳性区域。

二、阳性标记细胞学特征（以HRP-DAB/H2O2为例）

可分为①胞膜型；②胞核型；③胞质(浆)型；④微绒毛型和⑤复合型（胞膜-胞质兼有，胞核-胞质兼有，或微绒毛-胞质兼有）等五种阳性细胞类型。这与抗原所在部位相关联，但应注意排除因组织固定不好引起的抗原弥散假象，尤其是复合型图像。

三、阳性标记组织学特征（以HRP-DAB/H2O2为例）

免疫组化染色阳性细胞在组织中的分布排列形式可以有如下7种：①局灶型；②弥漫型；③片块型；④网状型；⑤腺管型；⑥腔缘型和⑦菊团型等。这主要取决抗原抗体复合物在细胞内的分布和阳性细胞在组织内的群体分布特点。

四、阳性标记强度特征

依照细胞阳性着色程度（抗原含量），可分为：

弱阳性（+）┅1分；

中等阳性（++）┅2分；

强阳性（+++）┅3分。

依照阳性细胞数量，可分为：

弱阳性（+ ，指阳性细胞总数在25%以下）；

中等阳性（++,指阳性细胞总数在25%—49%)；

强阳性（+++ ，指阳性细胞总数在50%以上)。

目前多采用积分综合计量。计算公式为：（+）%x1 +（++）%x2+（+++）%x3；总数值1.5者为(+++)。至少随机观察5-10个HPF。

如：