抗体如何选？WB、IHC、ChIP各种实验的抗体有什么区别？

说到-抗体相信各位科研达人一定不会觉得陌生，什么一抗，二抗，单克隆，多克隆，做WB、IP、IHC、IF、ChIP、FC各种专业名词闭着眼睛都能背出来，如今随着科研方向越来越广泛抗体的种类也日渐增多，如何在抗体大军中挑选出吻合实验的抗体对实验的成败显得尤为重要，今天就让我们来学习一下如何正确的选择自己需要的抗体。

不同实验对抗体有哪些要求？

工欲善其事必先利其器在选择抗体之前我们首先要知道我们所做的各种类型的实验都需要什么样的抗体，这样才能更好的理解抗体样式的选择方法。

1、WB（Western Blot）

WB的蛋白经过加热变性之后都变成线性的结构，因此最好的抗体是采用非常特异序列的人工合成多肽的方法来做实验，结果特异性也会比较高。

2、IP/CHIP（免疫共沉淀）

我们用抗体去结合生理状态下的蛋白质，因此IP的抗体最好使用纯化的天然蛋白制作的抗体来做，也可以用纯化的重组蛋白的抗体。最好不要用人工合成多肽制作的抗体，因为这种抗体识别的位点可能被深深地藏在了蛋白的内心深处。CHIP和IP没有太大的区别，唯一的问题在于，如果抗体识别的表位和该蛋白质与DNA结合的部位一致，则会导致CHIP实验的失败。

3、 IF/IHC(免疫荧光和免疫组化)

免疫荧光和免疫组化中需要进行固定一步，固定是为了尽量让细胞的形态结构维持和原有的一致。这种化学物质的固定使蛋白质变性凝固，与天然状态下的蛋白质有了一定的区别，但是又不同WB中加热变性变成了线性的结构。因此在做IF/IHC实验中，最合适的抗体可以是纯化的重组蛋白得到的抗体，也可以是人工合成多肽得到的抗体（多肽是在蛋白质的表面）

4、FC(流式细胞)

流式细胞中分为两种，一种是活细胞的流式，这种流式最好采用是天然蛋白或者重组蛋白的抗体来做，另外一种是经过固定之后的流式，和IF/IHC 所用抗体一致。在做流式细胞中，我们有直接标记和间接标记，间接标记不如直接标记真实准确。因此我们选择流式抗体要采用带有荧光标记的抗体；如果研究的蛋白没有直接标记的抗体，那么就采用间接标记抗体，需要添加荧光二抗。

特异性

特异性的选择主要需要考虑四个方面：蛋白特异性、种属特异性、实验方法特异性、标记物的特异性。

1、蛋白特异性

针对需要检测的蛋白查找抗体，几个细节要区分：

a.重组蛋白如果不是全长表达，则需要注意抗体的免疫原区域是否在重组蛋白区域内；

b.内源性蛋白最好能清楚其剪切与修饰的方式，特殊表型的蛋白需要进行序列比对，并结合抗体免疫原序列，查看交叉反应的情况；

c.磷酸化蛋白检测需要确定具体位点，不同位点的磷酸化意味着可能有不同的机制存在，不宜一概而论。

2、种属特异性

同种蛋白不同物种，有着或大或小的差异。

a.目前大部分商品化抗体都是以人源蛋白序列为模板重组蛋白或设计多肽抗原的，根据蛋白的同源性的情况与其他种属发生交叉反应。需要参照说明书注明的可反应种属信息。

b.一些稀有种属很难找到抗体，可以通过蛋白的序列比对，选择同源序列免疫的抗体，不过一般这种情况生产商不会受理其关于质量的申诉，如果可以申请到免费的抗体样品，则利于抗体选择。

3、实验方法特异性

目前使用抗体的实验方法有很多，不同的使用方法过程中，因为对蛋白样品的处理方式不一样，蛋白的含量有差异，对抗体的识别表位和效价要求都是不一样的。

4、标记物的特异性

一般基于实验操作的实验方法不会使用带有标记的一抗，比如 WB、IHC 等，都是通过二抗类的试剂标记达到结果呈现的目的。但是基于仪器分析的一些实验，可能就会使用到直接标记的一抗，比如流式实验。那么需要了解到自己将要使用的仪器能检测到的荧光范围，针对不同的参数要求选择对应的标记物。在免疫荧光双标实验中，需要选配不同的荧光标记物。

一抗的选择

1、目的蛋白的信息

首先我们要明确我们想要检测的目的蛋白与抗体识别蛋白信息是否吻合，注意中英文名字、别名等信息。某些蛋白具有多种不同的亚型，这需要在选择抗体之前确定要研究的蛋白亚型。还有些抗体由于其抗原选择的是不同蛋白亚型共有的肽段区域，是可以同时识别多个亚型的。

2、抗体应用的实验类型

其次我们要确定的就是我们需要抗体去做哪些实验，如WB /IHC /ICC /ELISA等，抗体在官网上或说明书都列出该抗体经验证适用于何种分析类型，如果抗体说明书没有说明提及的应用类型，则意味着该抗体不适用于标明以外的应用，或该抗体未经验证。例如：你需要做WB和石蜡切片的免疫组化则需要选择抗体标明WB和IHC-P，如该抗体只标明了WB或IHC-P,则不建议选择。

3、实验样本的种属信息

抗体一般会在出厂前对常见的不同种属目标样本进行内部验证，以确定可以满足的不同种属类型，可以在产品说明书的Species-Reactivity一栏中看到（如人、小鼠、大鼠等）。通过验证，达到质检要求的种属会明确标记，以备参考。没有做过关于这些种属的实验，所以不建议使用。

4、单抗和多抗的选择

在抗原抗体反应中，一般单克隆抗体特异性强，但亲和力相对小，检测抗原灵敏度相对就低；而多克隆抗体特异性稍弱，但抗体的亲和力强，灵敏度高。

二抗的选择

1、一抗的来源种属

主要根据一抗来源种属而决定二抗来源，如一抗是小鼠来源，那二抗就买抗小鼠的即可。

2、二抗应用的实验类型

针对不同的实验应用，需要考虑二抗所偶联的标记物，如HRP、Biotin、荧光素等标记物。WB与IHC所用的二抗，所带的标记物主要选择HRP和Biotin，而免疫荧光和流式应用可根据实验设计的需要，选择不同荧光素标记的二抗，如FITC、Cy3、PE等。做western blot最常用的二抗是hrp标记的二抗。

问题及经验借鉴

Q1. 做流式的抗体和免疫组化的抗体是一样的吗？

不一定能通用。流式是用直接标记还是间接标记？如果是直接标记的话，那这个抗体一般不是FITC标记或者就是TRITC，PE之类的。如果恰好你的免疫组化，也是想用荧光素标记的抗体来直接标记，那就可以通用。如果你的免疫组化要用其它的标记或者是间接标记的话，就会有麻烦，因为荧光素的标记很可能会影响二抗和一抗的结合。

Q2. 为什么我的抗体做WB非常好，而做不了IF，IHC等其他任何实验？

首先恭喜你有一个WB非常好的抗体，毕竟能获得做WB非常好的抗体也不容易。其次，你这个抗体很可能是通过人工合成多肽得到的，和上面所述，你用来做抗原的多肽恰好被包埋在蛋白质的中心，因此只能识别WB中线性的部分。

Q3. 如何选择免疫组化抗体？

首先，一抗是选择单克隆抗体还是多克隆抗体，单克隆抗体特异性强，灵敏度低；多克隆抗体灵敏度高，特异性弱。根据你的实验结果，如果非特异多，那么选择单克隆抗体；如果阳性信号弱，不妨选择多克隆抗体试试。一般家兔来源的都是多克隆，小鼠来源的是单克隆。其次是要弄明白该一抗能够识别什么种属的抗原，抗体说明书上面一般注明有，比如小鼠Mus, 大鼠Rat, 人Hum。在此比较重要的是要注意一抗的来源，比如我们在人的癌组织中做p53的免疫组化，一抗我们采用的是小鼠来源的p53抗体，那么二抗我们一定要选择抗小鼠的二抗比如（山羊抗小鼠，兔抗小鼠），这一点非常重要。最后，一般的抗体说明书都会注明能做什么实验，如果标明了不可以做免疫组化，一定不要选择。

Q4. WB和IF的二抗是一样的吗？

不是！免疫荧光抗体是用于免疫荧光试验的，是用FITC或PE等标记的抗体，结果需要紫外线激发并用荧光显微镜观察WB抗体一般是HRP或碱性磷酸酶等标记的抗体，需显色底物（如TMB等）直接显色（肉眼）或化学发光法显影（需特殊仪器）。

Q5. 做CHIP的抗体是否可以用来做WB抗体？

不一定，一般来说做CHIP级别的抗体对抗体纯度特异性方面都要求比较高，基本上能做CHIP的抗体都可以做WB。但是如果CHIP的抗体识别的是构象表位（比如是由两个实际靠在一起但变为线性结构之后相隔很远的两端序列），而不是线性表位，这种CHIP抗体做不了WB。

Q6. 抗体说明书上面没有写该抗体能够用于某项实验怎么办？

抗体研发出来之后都要经过WB，IP，IF，IHC实验。当发现浓度不够做IF，IHC时候，国外的抗体一般都是写未检测，国内的抗体一般是不写，所以不要抱着试试的心里去尝试，通常这样尝试只会浪费时间。

Q7. 做ELISA的抗体能否用来做WB？

通常用WB抗体稀释浓度为1:1000，IF/IHC为1:100，而如果可以做ELISA则可以稀释1:10000。如果一个抗体用来做ELISA的，那么言外之意就是该抗体效价不高。但不是说ELISA的抗体不能用于做WB，抗体说明书提示做ELISA稀释比例为1:1000，那么你可以试试1:100做做WB。

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