从技术难点剖析“为什么双抗研发看平台”（上篇）

作者：药链圈

业内对于抗体药物研发最常见的总结是“单抗看靶点，双抗看平台”，顾明思义就是单抗药物研发主要在于企业选择的靶点是什么，而双抗药物研发则主要在于企业是否具有核心的双抗技术平台。

本文结合双抗药物分子的结构特性等，解读双抗研发过程中的关键技术难点，进一步阐明“为什么双抗研发看平台”。上篇重点聚焦双抗研发的技术难点，下篇将重点介绍国内外主流的双抗平台。

双抗研发的技术难点

从易于理解的角度讲，双抗是将两个不同的单抗结构融合而形成的，但事实上，双抗的研发远要比我们想象的复杂，涉及到双链错配这一特有的技术难点，因分子结构是否存在Fc片段引起的组织渗透性、免疫原性、半衰期、稳定性等问题，以及功能性、亲和力、效价（抗原结合的数量）、抗原特性等多方面问题，双抗药物研发门槛非常高，要达到安全性、有效性、成药性的平衡远高于单抗药物。

图：单抗与双抗分子结构差异比较

1.双抗开发中的链错配问题

链错配问题是双特异性抗体药物研发特有的技术难点，也是双抗药物开发最初遇到的挑战之一。之所以会产生链错配问题，还要从抗体结构说起。天然抗体由四条多肽链组成，分子量较大的两条称为重链（H链），分子量较小的两条链称为轻链（L链）。在单抗结构中，两条重链和轻链的氨基酸组成完全相同，四条链组合后仅有一种结构。但双抗与单抗不同，双抗研发是通过共表达两条不同的重链和两条不同的轻链，来实现可以同时特异性结合2个不同抗原的目的，因此在四条链组装的过程中，2条重链和2条轻链可随机产生16种可能的结构组合，即便将其中互为镜像的结构合并后，仍然有10种不同的抗体结构，但其中只有一种是目标产物。况且这10种不同双抗产物的生化特性极为相似，因此从中分离出目标产物的难度极大。这种情况在单抗生产中不常见，也是造成双抗产量低、有杂质蛋白、生产成本较高的根本原因。

图：双抗药物重链和轻链组合

解决重链和轻链错配的问题是双抗技术平台的核心价值。常见的解决链错配问题的方法有：

（1）解决重链错配的Knobs-into-Holes（KiH）技术。本质上是基于空间位阻的促进重链异二聚体化的技术，可有效解决异源抗体重链错配的问题，但无法解决轻链配错的问题。

（2）解决重链轻链错配的CrossMab。主要通过对其中一个抗体的重链和轻链进行区域互换达到防止错配的目的，这是比较经典的轻链和重链防错配方法。

（3）抗体交界面静电设计技术。利用氨基酸电荷的同种电荷相互排斥，异种电荷相互吸引。典型代表如罗氏的ART-Ig技术平台。

诸如此类，还有很多技术平台将在下篇重点讲述。

2.Fc片段存在与否所引起的相关问题

Fc片段是天然抗体分子存在的基本结构单元，由于双抗是利用DNA重组和蛋白质工程技术手段制备的，结构上相比单抗更加多样。根据结构左右对称可以分为对称结构和非对称结构，根据抗原结合区域的数量可以分为二价、三价、四价或更多价构型，根据是否具有Fc区可以分为全长双抗（结构与lgG型单抗类似，含Fc区）和片段双抗（由lgG型单抗的Fab区组成，不含Fc区）。

图：全长双抗和片段双抗图示

双抗药物研发中，是否保留Fc片段或者对其进行工程化改造是需要重点考虑的问题。这是因为抗体Fc区存在与否直接影响双抗药物肿瘤组织渗透性、免疫原性、半衰期、稳定性、聚合问题和研发生产成本等。

对比来讲，全长双抗相对分子量通常较大，因此对肿瘤组织的渗透性相对较差，而且生产工艺相对复杂，生产成本较高。此外，因为Fc片段被认为具有免疫原性，所以全长双抗更易引起非肿瘤依赖的T细胞激活，极端情况会造成细胞因子风暴，通俗点讲就是T细胞失去控制后无差别攻击肿瘤细胞和人体正常细胞，因此全长双抗研发中往往需要对Fc区进行工程化改造以降低其免疫原性。

与之相反的是片段双抗分子量较小，易于生产，具有较高的肿瘤组织渗透性，而且因为缺乏Fc片段，仅通过抗原结合力发挥治疗作用，所以具有较低的免疫原性，被认为具有更强的治疗效果；但是也因为缺乏Fc片段，半衰期也较短，如BiTE双抗分子的半衰期只有2小时，此外也可能出现稳定性和聚合问题。

反观全长双抗，Fc片段的存在使其可与受体FcRn结合，减少在细胞内的降解，药物半衰期可超过1周，此外Fc片段还可与免疫细胞上的受体结合，激发抗体依赖细胞介导的细胞毒性作用（ADCC）、补体依赖的细胞毒性作用（CDC）及抗体依赖的细胞介导的吞噬作用（ADCP），多管齐下杀死肿瘤细胞。

图：ADCC、CDC、ADCP作用机制图示

综上分析，Fc区存在与否对双抗药物的影响具有两面性，在实际研发中，需要结合临床适应症，有针对性选择抗体分子大小，考虑是否保留Fc区。双抗技术平台的构建也因此有所区别。典型的片段双抗技术平台如安进的BiTE平台、赛诺菲的Nanobody平台等；典型的全长双抗技术平台如罗氏的KiH平台、CrossMab平台、ART-lg平台，以及艾伯维的DVD-lg平台等。（具体将在下篇展开讲述）

图：全长双抗和片段双抗相关平台

3.功能性、亲和力、效价等其他研发问题

功能性问题：任何一个双抗分子都存在特定的功能性，这是双抗药物发挥生物效应的关键。虽然说双抗分子的设计是结合了具有不同特异性的抗体片段而形成的，但是抗体片段经过重新构建后，其功能性与亲本抗体仍然会产生差异。因此在双抗的筛选发现中，单单从亲本抗体的特征并不能预测最有效力的双抗分子。实际上，双抗的优化往往需要基于经验在大量的抗体组合库中筛选。

亲和力问题：抗原和抗体在特异性结合时会表现出不同程度的亲和力，通常情况下，高亲和力的抗体与抗原的结合力强，也就是说即使抗原浓度很低时也有较多的抗体结合抗原形成免疫复合物。但是在实际的双抗研发中发现，并非是亲和力越强越好。例如靶向T细胞和抗原CD3的双抗分子中，低亲和力的CD3结合臂更利于双抗分子在肿瘤中的分布，并且避免了在脾、淋巴结等含T细胞的组织中富集。

效价问题：双抗分子的效价设计也是影响其活性的关键因素。再以靶向T细胞和抗原CD3的双抗分子举例，通常仅用单价的CD3结合臂就能实现肿瘤依赖性的T细胞激活功能，并且可以避免由于CD3分子在T细胞表面交联引起的抗原调变或者细胞因子释放。但是需要注意的是，靶向肿瘤抗原的抗体价数需要根据肿瘤抗原的特性来决定。

上篇小结：正因为双抗药物结构的特殊性和多样性，链错配、稳定性、免疫原性、分子聚合、半衰期等问题在双抗研发中屡见不鲜，所以解决研发技术问题的平台百花齐放，而基于平台技术的双抗企业也将在双抗药物领域占有一席之地。下篇中，我们将重点介绍国内外主流的双抗技术平台及其特性。

参考资料：

1.《双特异性抗体行业深度报告：曙光初现的抗体V2.0，聚焦肿瘤领域》

2.《2020年中国双特异性抗体行业投资机会分析》

3.《2020年中国双特异性抗体行业概览》

4.《行业领先的双特异性抗体平台领跑者》

5.《刘跃：双特异性抗体开发的关键和难点》

6.《行研|双特异性抗体药物技术概览》