Neurosci Bull︱仝黎课题组揭示VTA

撰文︱宋燕平

责编︱王思珍

近年来，全身麻醉机制的网络调控研究取得重大发展，在中枢神经系统内存在多种神经递质系统，相互关联的数个核团通过神经元间相互投射联系构成复杂多样的神经网络，从而调节全麻觉醒。主流观点认为全麻药物主要通过“自下而上”（bottom-up）以及“自上而下”（top-down）两种调控机制发挥作用[1]。

多巴胺（dopamine，DA）是大脑内十分重要的神经递质，在机体的认知、记忆、运动、情感、神经内分泌等方面都发挥着重要的作用。中脑腹侧被盖区（ventral tegmental area，VTA）是多巴胺合成和释放的主要场所之一，参与奖赏、目标导向行为、睡眠觉醒等神经活动[2]。有研究报道，在异氟烷麻醉下，光遗传激活VTA区的多巴胺能神经元能够产生快速觉醒的效应，并且腹腔给予多巴胺1受体阻断剂之后，这种促觉醒的作用可以被抑制[3]。此外，VTA多巴胺能神经元可以投向内侧前额叶皮质（medial prefrontal cortex，mPFC）并参与到认知、痛觉、抑郁样行为、药物成瘾、奖赏与厌恶等神经活动[4]，是“自下而上”激活系统通路的重要组成部分。mPFC是与觉醒水平密切相关的脑区，在认知、记忆、情感、奖赏、决策、学习行为等大脑高级功能中具有重要作用[5]，单一的长时间应激可引起mPFC神经元的过度激活，特别是在其分区，即缘前皮质（prelimbic cortex，PrL），导致睡眠-觉醒脑电图紊乱[6]。然而，关于PrL调控麻醉的研究很少，因此VTADA-PrL上行通路在麻醉中的作用，尚不清楚。

2021年12月26日，中国人民解放军总医院麻醉手术中心的仝黎课题组在《神经科学通报》（Neuroscience Bulletin）上发表了题为“Dopaminergic Neurons in the Ventral Tegmental–Prelimbic Pathway Promote the Emergence of Rats from Sevoflurane Anesthesia”的研究论文，提出VTA-PrL神经通路中多巴胺能神经元在大鼠七氟醚全身麻醉中发挥促觉醒作用。宋燕平、楚睿通和曹福羊为论文共同第一作者，仝黎副主任医师、米卫东教授、郭永馨主治医师为论文共同通讯作者。在此项研究中，作者发现，腹腔注射和在PrL区立体定位注射多巴胺D1受体激动剂（Chloro-APB）对大鼠七氟醚麻醉有促觉醒作用，而注射多巴胺D1受体拮抗剂（SCH23390）使麻醉加深。化学遗传学结合立体定位注射和光遗传学的结果显示，激活VTADA-PrL通路可延长麻醉诱导时间，缩短麻醉苏醒时间。这些结果表明，VTA多巴胺能系统具有促觉醒作用，自下而上的VTADA-PrL通路促进七氟醚麻醉的苏醒。

多巴胺已被证实具有促进麻醉觉醒的作用[2]。七氟醚（sevoflurane）XXX。为了进一步探究多巴胺在七氟醚身麻醉中的作用，作者通过腹腔给药的方式比较SCH组（多巴胺受体拮抗剂SCH23390）、APB组（多巴胺受体激动剂Chloro-APB）与对照组CON组（生理盐水）在2.4%七氟醚麻醉中翻正反射时间，来验证体内多巴胺递质系统在七氟醚吸入麻醉中的作用。腹腔注射后15分钟进行翻正反射试验，结果显示SCH组麻醉诱导时间比CON组明显缩短，觉醒时间明显延长；APB组七氟醚麻醉诱导时间比CON组明显延长，觉醒时间明显缩短（图1 B, C）。这些结果表明多巴胺系统在七氟醚麻醉诱导和苏醒过程中均可发挥促觉醒作用。PrL是多巴胺调控的重要靶向脑区（图1 A），作者通过核团给药的方式探究PrL在七氟醚麻醉中作用。与CON组相比，PrL局部给予SCH23390麻醉诱导时间明显缩短，觉醒时间明显延长；给予Chloro-APB麻醉诱导时间明显延长，觉醒时间明显缩短（图1 D, E）。这些结果（图1）整体表明：在七氟醚麻醉中，PrL是多巴胺系统的一个重要调控部位，多巴胺通过调控PrL发挥促觉醒作用。

图1 多巴胺神经递质系统延长七氟醚麻醉诱导，并通过PrL区促进麻醉觉醒

（图源：Song, YP. et al., Neurosci Bull, 2021）

为了进一步探讨VTADA神经元在七氟醚麻醉中的作用，作者采用化学遗传学方法将hM3Dq病毒及可特异性识别多巴胺能神经元的TH-Cre病毒以体积为2:1混合后注射入VTA脑区，对照组注射mCherry与TH-Cre。图2 B显示病毒表达（红）与多巴胺能神经元（绿）重合率很高（图2 B）。病毒充分转染表达4周后，腹腔注射CNO或生理盐水，2.5小时后进行翻正反射实验（图2 A），结果显示，hM3Dq + CNO组与其他三组相比，麻醉诱导时间明显延长，麻醉觉醒时间明显缩短（图2 C）。腹腔给予CNO2.5小时后，小鼠灌注取脑组织，c-fos免疫荧光染色结果显示hM3Dq + CNO组VTA的多巴胺能神经元c-fos表达明显增高（图2 D），说明hM3Dq + CNO组的多巴胺能神经元可以被CNO显著激活。对脑电频谱图分析发现，在翻正反射消失前，hM3Dq + CNO组的睡眠前的低频波段δ功率的百分比下降，而与清醒相关的高频波段β功率的百分比增加；而在翻正反射恢复期间，hM3Dq + CNO组的低频波段δ、α功率的百分比下降，而高频波段θ、β、γ功率的百分比增加（图2 E, F）。这些结果（图2）综合说明：激活VTADA神经元使得麻醉诱导时间延长及觉醒时间缩短，在七氟醚麻醉中有促进觉醒的作用。

图2 VTADA在七氟醚麻醉中有促觉醒作用

（图源：Song, YP. et al., Neurosci Bull, 2021）

为了探究VTADA-PrL神经通路在麻醉中的作用，作者使用化学遗传学方法在VTA注射hM3Dq病毒，在PrL注射TH-Cre病毒（图3 B）。病毒注射完成后充分转染表达四周后腹腔给予CNO（图3 A），可特异性激活投射向PrL区的VTA核团多巴胺能神经元，CNO注射2.5小时后的行为学结果显示，hM3Dq + CNO组与其它组相比，麻醉诱导时间有所延长，觉醒时间缩短（图3 C）。VTA免疫荧光染色显示，hM3Dq + CNO组多巴胺能神经元在腹腔给予CNO后c-fos表达明显增高（图3 D）。脑电频谱分析显示，激活VTADA -PrL通路后，睡眠相关低频区活动减弱，觉醒相关高频区活动增强（图3 E, F）。这些行为结果和脑电图结果（图3）表明：七氟醚麻醉诱导和苏醒过程受VTADA-PrL投射的调节。

图3 化学遗传学激活VTADA-PrL通路延长了七氟醚麻醉诱导时间，缩短了苏醒时间

（图源：Song, YP. et al., Neurosci Bull, 2021）

此外，在VTA注射hM3Dq及TH-Cre混合病毒，同时在PrL区埋置微注射套管，病毒充分转染后，由PrL区套管注射CNO，特异性激活由VTA核团投射到PrL区的多巴胺能神经元轴突末梢（图4 A, B），发现，hM3Dq组与其他三组相比，七氟醚麻醉诱导时间延长，麻醉觉醒时间缩短（图4 C）。脑电频谱分析显示，睡眠相关低频区活动减弱，觉醒相关高频区活动增强（图4 D, E）。通过化学遗传学结合核团给药的方法证实：VTADA-PrL通路在七氟醚的麻醉-觉醒过程中的促觉醒作用。

图4 化学遗传学结合核团给药激活VTADA-PrL通路延长了七氟醚麻醉诱导时间，缩短了苏醒时间

（图源：Song, YP. et al., Neurosci Bull, 2021）

为了更精准地调控VTADA-PrL这条神经通路，作者采用了高度时间和空间特异性的光遗传学技术。在VTA注射500 nl体积比为2:1的ChR2病毒和TH-Cre病毒，在PrL埋置陶瓷插芯（图5 A）。麻醉诱导的行为学实验显示：光照激活PrL后ChR2 + light on 组的麻醉诱导时间延长（图5 B, D）。脑电信号分析结果表明，与深睡眠相关的低频波段δ、与闭目安静状态相关的波段α在ChR2+light on组所占比例均有所下降，而与觉醒相关的高频段波段γ占的比例则有所增高（图5 E, F）。免疫荧光染色显示，PrL区进行光照15分钟后，c-fos、TH共染显示部分多巴胺能神经元活性增高（图5 C）。这些结果（图5）说明：VTA区多巴胺能神经元通过投射到PrL延长麻醉诱导时间。

图5 光遗传激活VTADA-PrL通路延长七氟醚麻醉诱导时间

（图源：Song, YP. et al., Neurosci Bull, 2021）

在翻正反射消失测试至少5天后测量翻正反射恢复的时间，以允许小鼠能够在麻醉和光学刺激后恢复。麻醉觉醒时间行为学显示，蓝光照射PrL后，ChR2 + light on 组麻醉觉醒时间缩短（图6 A-C）。脑电信号进行功率谱分析发现，ChR2 + light on组δ波减少，β、γ波的比例增加（图6 D-F）。这些结果（图6）说明：VTA区多巴胺能神经元通过投射到PrL促进麻醉觉醒。

图6 光遗传激活VTADA-PrL通路缩短七氟醚麻醉苏醒时间

（图源：Song, YP. et al., Neurosci Bull, 2021）

七氟醚作为临床常用药物，本研究补充了VTA多巴胺神经元在七氟醚麻醉下的重要作用，强调了VTA -PrL投射在中脑-皮层上行投射中不仅在认知、药物成瘾、奖赏等发挥重要作用，并且在麻醉中发挥了促觉醒作用。揭示了PrL区作为皮层的重要区域，同样在麻醉中发挥了重要作用。此外，mPFC通过与丘脑、中脑等部位的众多核团的联系，参与认知、疼痛等调节，说明PrL可能是Top-down机制中的重要起点，为下一步研究前额叶皮层在全麻觉醒中的重要作用，以及进一步探索Top-down机制提供了思路。

当然，这项研究也有不足之处，目前尚未证明VTA发出的多巴胺能神经元投射到PrL的神经元种类，多巴胺递质是如何在该神经环路中发挥作用的，以及PrL-VTA神经通路在麻醉中的作用，仍需要进一步探讨研究。

总之，该研究证明了VTADA-PrL神经通路在七氟醚麻醉诱导和苏醒过程中均发挥了促觉醒的作用，从而为全麻药物作用靶点方向的研究提供了相关理论依据，也为我们更好地去理解其它相关脑科学问题做出贡献。

原文链接：https://doi.org/10.1007/s12264-021-00809-2

通讯作者：米卫东（左）、 仝黎（右）

（照片提供自仝黎实验室）

参考文献 

[1] Mashour GA, Hudetz AG. Bottom-up and top-down mechanisms of general anesthetics modulate different dimensions of consciousness. Front Neural Circuits 2017, 11: 44.

[2] Eban-Rothschild A, Rothschild G, Giardino WJ, Jones JR, de Lecea L. VTA dopaminergic neurons regulate ethologically relevant sleep-wake behaviors. Nat Neurosci 2016, 19: 1356–1366.

[3] Taylor NE, Van Dort CJ, Kenny JD, Pei J, Guidera JA, Vlasov KY, et al. Optogenetic activation of dopamine neurons in the ventral tegmental area induces reanimation from general anesthesia. PNAS 2016, 113: 12826–12831.

[4] Carr DB, Sesack SR. Projections from the rat prefrontal cortex to the ventral tegmental area: Target specificity in the synaptic associations with mesoaccumbens and mesocortical neurons. J Neurosci 2000, 20: 3864–3873.

[5] Mininni CJ, Caiafa CF, Zanutto BS, Tseng KY, Lew SE. Putative dopamine neurons in the ventral tegmental area enhance information coding in the prefrontal cortex. Sci Rep 2018, 8: 11740.

[6] Lou TT, Ma J, Wang ZQ, Terakoshi Y, Lee CY, Asher G, et al. Hyper-activation of mPFC underlies specific traumatic stress-induced sleep-wake EEG disturbances. Front Neurosci 2020, 14: 883.

制版︱王思珍