组学研究“粪便君”样本如何收集？这里有高招哦～

科研道路千万条，漂亮数据第一条，

样本准备整不对，说啥都是两行泪……

代谢组学和肠道微生物群密切相关，微生物能够产生许多化学物质，如激素和维生素。虽然，测序平台能够对复杂微生物群落进行16S测序分析，但注释信息很少，不能够提供其真实活动的信息，也无法辨别微生物的存活状态。而粪便中的代谢物是肠道菌群和宿主共同代谢的产物，能够弥补这一弊端。

粪便携带来自宿主、微生物群和食物残留物的许多生化化合物，而且还捕获了由宿主之间的相互作用产生的代谢产物，为研究宿主与其肠道菌群之间的这种代谢串扰提供了最直接的信息。与其他生物样本相比，粪便是一种绝对无创的生物样本，能够整体反映疾病条件下的代谢状况，因此，作为研究机体代谢的一个重要方面，粪便代谢的研究将为探讨疾病发病机制、增强临床诊断的客观性、研究药物药效作用及机制提供重要信息。

下面小鹿针对粪便样本的不同形态，不同部位、储存方式进行了对比，孰优孰劣？赶紧往下一探究竟啦！

01样本的均质化

1.不同部位的粪便样本菌群和代谢物分布不一样

由于粪便样品的异质性，可能会引起分析偏差。如图1 PCA散点图所示，顶部、边缘、中部和底部4个不同的位置获得的粪便样本与匀浆后的粪便样本，代谢轮廓存在显著差异[1]，并且这种分布方式在所有个体中均不一致，因此临床上冻存收集的新鲜粪便之前，需用无菌棒将样品混匀。

图1 | PCA散点图

2.个体差异

不同个体间的样本也会存在着差异，下图基于Shannon指数评估发现个体之间的alpha多样性差异明显，但却不会随着保存稳定剂的改变和保存时间的增加而改变。说明个体差异对微生物群落的影响大于其他条件[2]。

图2 | Shannon指数评估发现个体之间的alpha多样性差异

02不同形态粪便样本的稳定性

粪便样本采集时，除了直接冻存收集的新鲜粪便，还可以采用冻干的方式或者以粪水的形式存储。如下图所示，新鲜粪便在-20℃放置1h后，代谢轮廓就发生了较为明显的改变，粪水样本-20℃放置24h后代谢轮廓还是比较稳定的。但是相对于新鲜粪便，粪水在室温和冷藏条件下更不稳定。研究表明，粪水结合形式对于疏水性代谢物如长链醇、酯和甾醇类损失明显[3]，而冻干粪便冻干的过程会损失挥发性的代谢物如SCFAs[4]，因此我们要根据研究需求来选择适宜形态的样本。

图3 | 新鲜粪便与粪水样本的代谢轮廓差异

03储存条件对粪便代谢物的影响

收集完样本，有的时候我们不一定能立马就进行相关实验，需要先将样本储存一段时间。那选择怎样的储存条件，才能让我们的样本在保存时尽量减少代谢物的损失呢？

如下图所示，对室温、4℃冷藏和-20℃下的粪便样本储存不同时间，发现4℃下储存超过24小时后代谢物发生显著变化。室温可致乙酸和戊酸含量显著升高，而琥珀酸和富马酸含量显著降低。-20℃冷藏存储短时间内较为稳定，但不宜超过1个月。-80℃可放置3个月，因此样本收集完后，我们最优选择是干冰运输后立马储存于-80℃冰箱。

图4 | 对室温、4℃冷藏和-20℃下的粪便样本储存不同时间

04反复冻融对粪便样本的影响

粪便样本在混合储存条件下，由-20℃保存24h再到室温保存5h，相对于由4℃保存24h再到室温保存5h代谢轮廓更不稳定，尤其是氨基酸和尿苷这类物质有显著影响，过程样品发生了冻融。经研究，冻融第3次后的样本，对代谢物轮廓的发生了极为显著的差异。因此切记不可反复冻融样本，如果无法避免，冻融次数不得超过3次。

图5 | 反复冻融对粪便样本的影响

05总结

参考文献

1.Optimized Sample Handling Strategy for MetabolicProfiling of Human Feces.Analytical Chemistry.2016

2.Comparison of DNA stabilizers and storage conditions on preserving fecal microbiota profiles.2020

3.Global gas chromatography/time-of-flight mass spectrometry (GC/TOFMS)-based metabonomic profiling of lyophilized human feces. Journal of Chromatography B, 2013. 937:103-113.

4.Species variation in the fecal metabolome gives insight into differential gastrointestinal function. Journal of Proteome Research, 2008. 7:352-360.

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文章来源于鹿明生物