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大分子量蛋白WB师兄有一点小经验要传授给你！
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大分子量蛋白WB师兄有一点小经验要传授给你！
英文特生物技术北京有限公司
6月5日
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大分子量蛋白WB一直被大家吐槽难做，各种没结果，今天特意总结了师兄的一些tips给大家，快干了这杯干货！ 样品制备大分子量蛋白不好提取，因为许多大分子量蛋白是膜蛋白，膜蛋白属于非可溶性蛋白，且表达量通常较低，一般使用溶液法（RIPA等）裂解时，通常会丢失在不可溶组分中，所以要选择合适的方法来进行蛋白的提取或富集。提取总蛋白时建议适当延长孵育时间，有助于大分子量蛋白的充分裂解！（有效的提取总蛋白方法点击这里，富集膜蛋白的方法点击这里）
 SDS-PAGE电泳
1 分离胶的使用及浓度 凝胶主要有Tris-Glycine, Bis-Tris and Tris-Acetate三种，Tris-Glycine凝胶的PH为8.6，Bis-Tris凝胶的PH为6.4，Tris-Acetate 凝胶的PH为7。推荐使用Tris-Acetate 凝胶跑大分子蛋白，会呈现更高的分辨率。凝胶浓度与孔径成反比，即凝胶浓度越小，孔越大，较大分子量的蛋白质更容易通过，所以建议使用6-8％浓度的分离胶，当然也可以使用梯度凝胶。
经过小编的阅读查找，给大家找到了详细的参考资料以及Tris-Acetate 凝胶3-15%的梯度胶配方。（点击这里索要详细配方及参考文献） 2电泳 电泳时，可采用120-150V的高电压，在冰水浴中进行，尽量使Marker拉开足够大的距离，通常需要4小时左右。 一些经验值：师兄A：120V电压，4小时，245KD Marker条带差不多到分离胶中间位置。 转膜 1 转印膜的选择跑大分子量蛋白，一般建议使用0.45um的PVDF膜。 2切胶 浓缩胶不要切得太过，因为很有可能条带就在浓缩胶和分离胶交界以下2mm处（还有可能许多分子量超过250KDa的蛋白就残留在浓缩胶中）。 3Transfer buffer Transfer buffer中的甲醇容易让大分子量蛋白沉淀，所以减少Transfer buffer中甲醇百分比（10％或更低）来避免这种情况发生，并添加SDS至终浓度为0.1％，进一步确保蛋白质不会沉淀。4 转膜 湿转法与半干转法均可（湿转获得条带更好，半干转转膜效率高） 湿转法，以下是师兄B摸索出来转膜时间（仅供参考） 蛋白分子量 转膜电流 转膜时间 150-180KDa 300mA 3-3.5h 180-250KDa 300mA 4-5h 大于250KDa 300mA 5.5-6h
半干转，以下是师兄C摸索出来转膜条件（仅供参考） 恒压40V电压，转膜60-90min，一般小于400KDa的蛋白都能转到PVDF膜上。恒流法转，电流大小设置为PVDF膜的面积，转1小时左右即可，若怕转膜过头，可以将两张PVDF膜重叠起来（总会有一张膜上有条带）。 其他注意事项 强烈建议转膜后，使用丽春红染液染膜（Invent Cat# WA-004），检验转膜效率，蛋白条带分布和上样量如何，如果染色后无条带，则需考虑样品问题及转膜问题，进行调整。（ 丽春红染色怎么做点这里）因为多数大分子蛋白是膜蛋白，表达较少，建议适当增加上样量，并延长一抗孵育时间。
大分子蛋白与PVDF膜的结合不是很牢固，容易脱落，洗膜时要操作轻柔，不要过于粗暴，否则抗原抗体复合物容易脱落。
不知道以上的Tips是否帮到了做大分子量蛋白WB的你，在看的师兄师姐们，还有哪些做大分子量蛋白WB的经验也欢迎在留言区留交流哦！
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