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2020.8.5丨细菌基因组二代测序组装流程梳理
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step:1 准备工作step:2 数据过滤比对参考基因组安装BWA建立索引bwa一共有三种比对算法，这里使用mem
数据过滤安装samtools筛选三步走
step:3 组装step:4 共线性分析使用MUMmer进行分析安装mummer-3.23：联配相近序列数据整理
step:5-6 基因组环化+gap填充(尚未补充完整)step:7 组装评估
step:1 准备工作
获得原始数据 获得样本参考基因组或者知晓物种名称 step:2 数据过滤 比对参考基因组 安装BWA bwa-0.7.17:https://github.com/lh3/bwa/releases/download/v0.7.17/bwa-0.7.17.tar.bz2 #下载到安装目录解压缩 cd bwa make 或者 conda install bwa #（需要预装anaconda或者miniconda） 建立索引 bwa index refer_data/Escherichia_Coli_HIV-1.fa bwa一共有三种比对算法，这里使用mem bwa mem -t 4 ../refer_data/Escherichia_Coli_HIV-1.fa AW001-1_R1.fq AW001-1_R2.fq 数据过滤 安装samtoolssamtools 1.10:https://github.com/samtools/samtools/releases/download/1.10/samtools-1.10.tar.bz2 cd samtools-1.x # and similarly for bcftools and htslib ./configure --prefix=/XXX/to/install make make install #注意权限问题，有时候需要在命令前添加 sudo 筛选三步走 samtools view [options] in.sam|in.bam|in.cram [region...] #查看和转化SAM/BAM/CRAM文件，输出文件内部分序列等。第二步需要.sam文件，如果bwa已生成sam文件，此步骤可省略； samtools sort -@ 15 -l 5 -m 20M -n -o my_sorted.bam -O bam output.sam #对文件进行排序 #-@ INT 设定线程，默认为单线程 #-l INT 设定输出文件的压缩水平，0表示不压缩，1表示快速但低水平的压缩，9表示缓慢但高水平的压缩，范围是0或者1-9，如果不指定-I，则使用默认的压缩水平 #-m INT 设定每个线程需要的最大内存，使用K M G作为后缀，为了避免sort时产生很多中间文件，该参数最小值设为1M #-n 根据read name进行sort而不是根据染色体的坐标 #-o FILE 最后输出的文件，如果为空，就输出到标准输出中 #-O FORMAT 输出文件的格式，SAM/BAM/CRAM中选一个 samtools fasta input.bam -1 output_R1.fasta -2 output_R2.fasta #转化为fa格式准备组装,单端测序无需添加 -1，-2参数 step:3 组装这里我使用的是Abyss工具进行组装，详细的安装教程可以看这里：https://blog.csdn.net/yangl7/article/details/107706174 export abyss_home=/home/XX/soft/abyss-2.2.4/ export PATH=$abyss_home/ABYSS:$PATH abyss-pe name=mapping_ecoli k=n -o /h ome/yangxin/Assembly_result/n_contigs.fa in='/home/XX/plasmid_data/bwa_R1. fastq /hmoe/XX/plasmid_data/bwa_R2.fastq ' step:4 共线性分析 使用MUMmer进行分析测序技术刚开始发展的时候，大家得到的序列都是单个基因的长度，所以一般都是逐个基因的比较，用的都是BLAST或FASTA通过逐个基因联配的方式搜索数据库。但是1999年后，越来越多的物种全基因组出现，比如说在1999年出现了Helicobacter pylori的第二类菌株的基因组序列，就需要研究同一物种不同品系进化过程的基因组变化，比如说基因倒置现象。传统的BLAST/FASTA就用不了，就需要用到新的工具，这就是MUMmer出现的历史背景。那么MUMmer能用来研究什么呢？比如说细菌的不同菌株基因组中倒置现象，人和老鼠的基因组在进化上的重排现象。还有比较同一物种的不同组装结果等。MUMmer的算法基础(suffix tree)使得它的速度比BLASTZ(k-mers)快得多，但是灵敏度低，也就是检测不到比较弱的匹配，但是作者说这都是可以通过修改参数进行改善. 背景描述及流程参考：https://www.plob.org/article/11355.html 安装mummer-3.23： wget https://gigenet.dl.sourceforge.net/project/mummer/mummer/3.23/MUMmer3.23.tar.gz conda install mummer（需要预装anaconda或者miniconda） 联配相近序列 `nucmer --mum -p contigs ../0-ref/ref.fasta ../2-assembly/spades/contigs.fasta #将组装后的contigs与参考基因组比对` 数据整理 delta-filter -m contigs.delta > contigs.filter #数据过滤，指定匹配要求生成delta文件记录联配坐标 #-i: 最小的相似度 [0,100], 默认0 #-l: 最小的匹配长度 默认0. #-u: 最小的联配唯一度 [0,100], 默认0 #-o: 最大重叠度，针对-r和-q设置。 [0,100], 默认100 #-g: 1对1全局匹配，不允许重排 #-1: 1对1联配，允许重排，是-r和-q的交集 #-m: 多对对联配，允许重排，是-r和-q的合集。 #-q: 仅保留每个query在reference上的最佳位置,允许多条query在reference上重叠 #-r: 仅保留每个reference在query上的最佳位置,允许多条reference在query上重叠 show-coords -T -r -l contigs.filter > contigs.1coords #显示联配坐标表格 mummerplot --postscript -p contigs contigs.delta #生成.PS格式的绘图文件 ps2pdf contigs.ps contigs.pdf #生成共线性PDF
从step4开始手工操作，介于之前的质粒组装并不复杂，组装结果较好情况下，直接通过肉眼判断组装结果，这两步没有单独使用软件处理。后期遇到其他项目会对这两步进行补充 step:7 组装评估使用Quast软件评估 安装 conda install quast（需要预装anaconda或者miniconda） quast /home/XX/k_contigs.fa -t 8 -o k_quast可以生成PDF直接查看评估结果，一共有五页，除总表外还有contig的长度分布，GC含量比例等图，不一一展示了。 |
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