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您可点击此处下载蛋白质免疫印迹应用指南PDF文件 目录：WB实验方案溶液与试剂：裂解缓冲液溶液与试剂：电泳、转膜及封闭缓冲液样本裂解样本制备上样和跑胶蛋白转膜抗体染色WB实验疑难解答无信号或信号弱检测条带与预期大小不符或多带现象高背景其他问题 WB实验方案 溶液与试剂：裂解缓冲液这些缓冲液在 4 ℃ 下可保存数周，也可分装后在 -20 ℃ 下保存长达 1 年。 NP-40 缓冲液 RIPA 缓冲液（放射免疫沉淀检测缓冲液） Tris-HCl 1 × Hot Lysis裂解缓冲液 150 mM 氯化钠1.0% NP-40（可用 0.1% Triton X-100 代替）50 mM Tris-HCl，pH 8.0蛋白酶抑制剂150 mM 氯化钠1% IGEPAL CA-6300.5% 脱氧胆酸钠0.1% SDS（十二烷基硫酸钠）50 mM Tris-HCl，pH 8.0蛋白酶抑制剂20 mM Tris-HCl（三羟甲基氨基甲烷盐酸盐）蛋白酶抑制剂10 mM Tris-HCL（pH 8）1% SDS1.0 mM 正钒酸钠ddH2O溶液与试剂：电泳、转膜及封闭缓冲液Laemmli 2X缓冲液/上样缓冲液 电泳缓冲液（Tris-Glycine/SDS） 转膜缓冲液（湿转） 转膜缓冲液（半干转） 封闭缓冲液 4% SDS10% 2-巯基乙醇20% 甘油0.004% 溴酚蓝0.125 M Tris-HCl测定 pH 值并将 pH 值调整至 6.8 25 mM Tris base（三羟甲基氨基甲烷游离碱）190 mM 甘氨酸0.1% SDS测定 pH 值并将 pH 值调整至 8.3 25 mM Tris base （三羟甲基氨基甲烷游离碱）190 mM 甘氨酸20% 甲醇测定 pH 值并将 pH 值调整至 8.3对于大于 80 kDa 的蛋白，建议 SDS 终浓度为 0.1%。 48 mM Tris base39 mM 甘氨酸20% 甲醇0.04% SDS3–5% 牛奶或 BSA（牛血清白蛋白）加入 TBST 缓冲液。充分混合后过滤。不过滤可能会有斑点沉积，这种小暗点会在显色时影响实验结果。 样本裂解细胞培养裂解液的制备 组织裂解液的制备 将细胞培养皿放置冰上并用预冷的 PBS 洗涤细胞。吸出 PBS，然后加入预冷的裂解缓冲液（每 107 个细胞/100 mm 培养皿/150 cm2 烧瓶加 1 mL；每 5x106 个细胞/60 mm 培养皿/75 cm2 烧瓶加 0.5 mL）。用预冷的塑料细胞刮刀将贴壁细胞从培养皿上刮下，然后轻轻将细胞悬液转移到预冷的小离心管中。或者，用胰蛋白酶消化细胞并用 PBS 洗涤细胞，然后将细胞重悬浮于小离心管内的裂解缓冲液中。4 ℃ 下持续振摇 30 分钟。放入微型离心机，在 4 °C 下离心。您可能需要根据细胞类型改变离心力和离心时间；指南给出的参考标准是在 12,000 rpm 转速下离心 20 分钟，但须根据您的实验确定（白细胞所需的离心力很小）。轻轻地从离心机中取出离心管放置在冰上。将上清液吸出转移到放置在冰上预冷的新管中，弃去沉淀。用干净器械解剖目标组织，最好在冰上，并且越快越好以防蛋白酶降解。将组织放入圆底离心管或 Eppendorf 管中，浸入液氮中“速冻”。样本在 -80 °C 储存备用，或放在冰上立即匀浆。对于一块约 5 mg 的组织，向管中迅速加入约 300 μL 裂解液，并用电动匀浆器匀浆，2X 裂解液冲洗刀片两次，每次 200 μL，然后在 4 ℃ 下（例如将回旋振荡器放入冰箱）持续振摇 2 小时。裂解液的体积必须根据组织总量决定；蛋白提取物不宜过度稀释，以免造成蛋白损失，并尽量减少样本体积，以便凝胶上样。最小浓度为 0.1 mg/mL，最佳浓度为 1-5 mg/mL。在微型离心机中 4 ℃ 下按照 12,000 rpm 的转速离心 20 分钟。轻轻地从离心机中取出离心管放置在冰上。将上清液吸出转移到放置在冰上预冷的新管中，弃去沉淀。样本制备取少量裂解液，用于蛋白质定量分析。测定每种细胞裂解液的蛋白质浓度。确定蛋白质的上样量，并添加等体积的 2X 稀释 Laemmli 样本缓冲液。我们建议使用以下方法对样本进行还原和变性，除非在线抗体数据表显示应使用非还原和非变性条件。对样本进行还原和变性时，将样本缓冲液中的细胞裂解液在 100 °C 下煮沸 5 分钟。裂解液可等量分装并在 -20 °C 下储存备用。上样和跑胶1. 将等量的蛋白和分子量标志物上样至 SDS-PAGE 凝胶孔中。细胞裂解液或组织匀浆的总蛋白上样量为 20-30 μg，纯化蛋白的上样量为 10-100 ng。 2. 在 100 V 下跑胶 1-2 小时。 时间和电压可能需要优化。我们推荐按照制造商的说明进行操作。建议使用还原型凝胶，除非抗体数据表推荐使用非还原性条件。 凝胶百分比取决 于目标蛋白的大小： 蛋白大小 凝胶百分比 4–40 kDa 20% 12–45 kDa 15% 10-70 kDa 12.5% 15-100 kDa 10% 25-100 kDa 8% 也可以使用梯度凝胶。 蛋白从凝胶转移到膜膜可以是硝酸纤维素，也可以是 PVDF。用甲醇活化 PVDF 1 分钟，并在制备转膜层之前用转膜缓冲液冲洗 PVDF。转膜时间和电压可能需要优化。我们推荐按照制造商的说明进行操作。可在封闭步骤之前用丽春红染色法检查蛋白质转膜。 转膜层的制备如下： 图 1.制备好的转膜层示例。 抗体染色用封闭缓冲液在室温下封闭膜 1 小时或在 4 °C 下封闭过夜。用适当稀释的一抗在封闭缓冲液中孵育膜。我们建议在 4 °C 下过夜孵育；其他条件可以优化。用 TBST 洗涤膜 3 次，每次 5 分钟。用推荐稀释度的偶联二抗在封闭缓冲液中室温孵育膜 1 小时。用 TBST 洗涤膜 3 次，每次 5 分钟。产生信号时，请遵循试剂盒生产商的建议。除去多余的试剂，并用透明塑料膜覆盖膜。利用暗室显影技术采集化学发光图像，或利用常规图像扫描法采集比色检测图像。WB 实验疑难解答无信号或信号弱实验流程 原因 建议 相关靶点 靶点特性 组织或细胞中靶标蛋白含量低 参考文献或数据库数据等，确认靶标蛋白是否在待检组织或细胞中表达。 附录1 增加上样量，至少上样20-30 μg蛋白。 浓缩使信号最大化（例如检测核蛋白要用核裂解物；检测膜蛋白用膜裂解液，超速离心分离膜蛋白，注意带上特定组分的loading control）。 附录2 参考文献或产品说明书，诱导增加靶标蛋白表达。 附录3 选择确认表达靶标蛋白的样本作为阳性对照（可参考产品说明书中提供的阳性对照）。 组织或细胞中修饰后（磷酸化、乙酰化和泛素化等）的靶标蛋白含量低 通常情况下，在未处理的组织或细胞中，大部分翻译后修饰状态下的蛋白含量较少。 参考文献或产品说明书，诱导增加靶标蛋白含量。 附录3 裂解缓冲液中使用相应去修饰酶抑制剂。（例如靶蛋白磷酸化检测，裂解液中需增加磷酸酶抑制剂） 阳性对照（参考产品说明书中诱导试剂和条件，处理样本。） 分泌型蛋白 使用 Brefeldin A（BFA）抑制蛋白分泌，提取全细胞裂解液。 如果全细胞裂解液中检测不到靶蛋白，建议提取细胞培养上清中的蛋白。 样本制备 裂解不充分 超声破碎有利于蛋白释放，建议所有样本制备时，加入裂解液后都使用超声破碎裂解样本，特别是核蛋白。 附录2 转膜 转膜不充分 使用可逆染色剂例如丽春红检测转膜效果。 PVDF 膜使用前，需预先浸在甲醇中，然后浸到转移缓冲液中。 检查转膜操作是否正确。 小蛋白和大蛋白需注意PVDF膜孔径、转膜试剂和转膜时间等是否合适。 附录4 封闭封闭剂与一抗或二抗有交叉反应 使用温和的去污剂如吐温-20，或更换封闭剂（常用的脱脂奶粉、BSA、血清等）。 过度封闭使目标蛋白不能显色 代替 5% 脱脂奶粉，使用含 0.5% 脱脂奶粉或无脱脂奶粉的抗体稀释液，或更换封闭剂（例如5% BSA），减少封闭时间。 一抗孵育 一抗不识别检测物种的蛋白 参照说明书，比对免疫原序列和蛋白序列以确保抗体和目的蛋白会发生反应，设置阳性对照。 有些蛋白缩写名称相似或相同，参照说明书，确认抗体识别的靶标蛋白。 没有足够的一抗或二抗结合目标蛋白 使用高浓度抗体，延长 4 ℃ 孵育时间（如过夜）。 一抗反应性和敏感性限制 靶标蛋白种属是否在产品说明书列出的种属范围内。 抗体检测的样本是否指出仅检测recombinant fragment，若是则表明其不能检测内源样本。 一抗失效 使用新鲜稀释的抗体，重复使用有效浓度和稳定性会降低。 二抗孵育 一抗和二抗不匹配 二抗需和一抗宿主的物种相同（如一抗来自兔，二抗为抗兔抗体）。 二抗受叠氮钠抑制 避免叠氮钠和 HRP 标记抗体一起使用。 洗膜 洗膜过度 勿过度洗膜。 检测 检测试剂盒过期和底物失活 使用新鲜的底物。 检测条带大小与预期不符或多带现象实验流程 原因 建议 相关靶点 样本和靶标蛋白 细胞传代次数过多，使其蛋白表达不同 使用原始未传代的细胞株，和现在的细胞株一起做平行对照实验。 蛋白样本降解（蛋白质分子量降低） 在样品缓冲液中加入足够的蛋白酶抑制剂。 体内表达的蛋白样本具有多种修饰形式如乙酰化、甲基化、烷基化、磷酸化、糖基化等 查阅文献，检查是否有多带报道。 附录5 由于翻译后修饰（PTMs），如磷酸化和糖基化或选择性剪接变异体，许多蛋白质显示的条带分子量略高于预期或出现弥散条带 附录6 为了确认额外的条带是由翻译后修饰引起的，可以用合适的试剂处理样品来处理修饰过的蛋白质。 例如，PNGase F可以去除糖基化， 当处理后再进行WB实验时，额外的糖基化条带应该会消失。 附录6 靶标蛋白含有多个异构体 查阅资料，看看是否有异构体。 附录4 查看免疫原序列，判断抗体是否识别异构体或者剪切体。 检测到未经报道过的新蛋白或同一蛋白家族中具有相似表位而结构不同的蛋白 查阅其它文献报道，或 BLAST 搜寻，使用说明书推荐的细胞株或组织。 样本制备 靶蛋白形成多聚体 这可能出现高分子量的额外条带，它们的分子量可能是预期条带的2倍或3倍。 附录6 SDS-PAGE 电泳上样前，煮沸 10 分钟而不是 5 分钟，使蛋白质解聚。 对于多次跨膜蛋白，可尝试不煮样或使用较温和的煮样方式。 附录2 封闭条带为非特异性条带应用封闭多肽来区分特异性和非特异性条带，只有特异性条带能被封闭从而消失。一抗孵育 一抗浓度过高，高浓度时常出现多条蛋白带 降低抗体浓度和/或孵育时间。 抗体未经纯化 使用亲和纯化的抗体，减少非特异条带。 二抗孵育 二抗浓度过高，高浓度产生非特异性结合 降低抗体浓度，增加二抗对照（只加二抗不加一抗的对照）。 高背景实验流程 原因 建议 转膜 膜的选择导致的高背景 NC 膜比 PVDF 膜背景低。 封闭 未进行非特异性封闭或封闭不充分 延长封闭时间，考虑更换合适的封闭剂。Abcam 推荐 5% 脱脂奶粉、3% BSA 或血清封闭 30 分钟。这些可以包含在抗体缓冲液中。 一抗孵育 一抗浓度过高 稀释抗体至合适浓度，以更高稀释度抗体孵育更长时间（耗时长但特异性结合最好）。 孵育温度过高 4 °C 孵育。 二抗孵育 二抗与封闭剂非特异性结合或反应 设置二抗对照(不加一抗)。 一抗或二抗与封闭剂有交叉反应 在孵育和洗涤液中加入温和去污剂如吐温 -20。 脱脂奶粉含有酪蛋白，对于酪蛋白激酶，该蛋白本身就是一种磷酸化蛋白底物，有可能会结合磷酸化特异性抗体而易产生高背景。使用 BSA 代替奶粉作为封闭剂。 膜 膜干燥 在孵育过程中防止膜变干，在任何步骤都保证膜有充分的反应液，放入搅拌子不断搅动或轻轻振荡使膜浸在溶液中，避免出现干膜现象。 洗膜 未结合蛋白质洗涤不充分 增加洗涤次数。 丽春红自发荧光 如果使用荧光检测，一定要在免疫染色前完全去除丽春红，因为它可以自发荧光。 检测 底物过多(如果使用酶联抗体)。 稀释底物，缩短底物孵育时间。 信号放大可能太高（如果使用信号放大技术） 减少信号扩增的倍数（例如，如果使用生物素化，将较少的生物素结合到二抗）。 其他问题问题分类 实验流程 原因 建议 背景有不均匀的白色斑点 转膜 转膜时膜上有气泡或抗体在膜上分布不均 转膜过程中尽量去除气泡，抗体孵育时保持摇动。 背景有黑色斑点 封闭 抗体结合了封闭剂 过滤封闭剂。 深背景出现白色条带（非预期背景） 抗体孵育 一抗或二抗加入过多 稀释抗体的浓度。 分子量蛋白标准条带呈黑色 电泳 抗体和分子量蛋白标准发生了反应 在分子量蛋白标准和第一个样品之间增加一个空白条带。 目的条带染色过低/过高 电泳 分离不彻底 改变凝胶比例：分子量大的蛋白用低浓度胶，分子量小的蛋白用高浓度胶。 “微笑”条带 电泳 迁移过快 降低电泳电压，以降低迁移速度 电泳温度过高（改变了 pH 值和迁移速度） 低温电泳(冷库或冰上)。 相同的蛋白杂交出现大小不均匀条带 电泳 制备凝胶时凝胶凝固太快，致使泳道中丙烯酰胺的比例不均匀 参照凝胶的配方，在凝胶中加入适量 TEMED，放置时在凝胶顶部加入适量 0.1% SDS（水稀释）以防凝胶变干。 凝胶染色不均匀 试剂和抗体 细菌污染 4 °C 保存抗体并使用新鲜的缓冲液浸泡凝胶。 抗体量不足 确保在振荡孵育时抗体充分浸没膜。 |
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