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Western blot 实验技巧精要
——轻松获得高质量 western blot 条带图
Western blot 方法在 SCI 文章中出现的频率非常高,漂亮的 WB 电泳图可以给文章增色不少。但是 WB 实验的步骤琐碎,细节颇多,要想得到令人满意的结果还是需要花费很多时间和精力去摸索实验技巧的。
小编经过了一段时间的努力,已经可以比较轻松的实现用 WB 方法对磷酸化蛋白计算药物的 IC50 值(见下图)。
接下来,小编将结合自己的经验以及网上可以搜索到的 WB 实验技巧,为大家介绍一下 WB 实验过程中的关键点。虽然 WB 实验步骤很多,但只要抓中其中的几个重点方面,就可以得到干净、漂亮、清晰、客观的电泳图。
一、 样品准备部分
小编认为,我们不应该太过重视 WB 电泳部分的操作技巧,样品准备才是整个 WB 实验中最重要的一个环节(没有之一)。否则 WB 电泳技术再高也无法得到好的结果。小编认为以下 3 点值得大家重点关注:
1. 注意孵育、终止时间
如果想得到漂亮的梯度条带,无论是不同处理时间的样品,还是不同给药浓度的样品,在处理过程中都一定要严格按照设计的时间来孵育和终止,尤其是对于磷酸化蛋白,哪怕 1 秒也不要提前或耽搁。
2. 抑制蛋白降解
这是样品制备中最需要注意的部分。抑制样品蛋白降解的方法主要有两种:
(1) 使用蛋白酶抑制剂
小编使用的是罗氏公司(Roche)的蛋白酶抑制剂 Cocktail 片剂,效果不错。再与 PMSF 共同使用,可以很好地抑制蛋白降解。
(2) 全程低温操作
提前预冷 PBS、裂解液甚至枪头等,从收集细胞开始一直到煮样的全过程都应该尽可能的保持在冰上操作。小编除了使用冰盒,大多数操作都是在 4℃冷房中进行的,虽然有点麻烦和辛苦,但是效果非常好。
3. 裂解液用量
将收集好的细胞加入裂解液进行裂解在操作上是非常简单的,所以这一步的重要性很容易被大家忽视。裂解液的用量直接决定了细胞裂解程度以及裂解后的蛋白浓度。
如果加入的裂解液不足,蛋白浓度太高,会造成与上样缓冲液反应不充分,电泳后会出现多条条带,条带形状也不好。小编做磷酸化蛋白检测时为了在每个胶孔中尽可能多上样,所以用体积较少的裂解液制备了浓度很高的蛋白,结果就得不偿失了(见下图)。
![]() 这种情况的补救方法是给样品继续补加上样缓冲液,煮样,再跑胶。直接给已经煮过样的样品补加上样缓冲液再煮样,跑胶后的效果也会好很多(见下图)。 ![]() 当然,也不要忘了赶气泡,赶气泡时方向不要太随意,也不要太用力,否则可能会使胶变形,尤其是边缘部分,然后你的条带就会……比较有艺术感了……(见下图) ![]() |
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