英文特生物技术(北京)有限公司 inventbiotech 欢迎您....

蛋白质样品制备是western blotting(WB)实验的第一步，其目的是获取高品质蛋白质样品，以提高实验的成功率。WB实验蛋白样品制备应遵循以下原则：

蛋白样品制备一般经过样品的破碎、样品裂解以及杂质的去除，最终获得蛋白溶液。

获取目标蛋白信息

在提取蛋白样品前，我们首先要了解目标蛋白的详细信息——目标蛋白名称、目标蛋白在哪些组织中表达、目标蛋白的分子量、目标蛋白在细胞中的表达位置及表达量、是否有相应的抗体等。

如何获取这些信息呢？最重要的方法当然是文献查询，此外还可以借助生物信息学方法帮助我们了解目标蛋白，比如维基百科，NCBI，ExPASy等进行查询。

当然还可以利用一些产品信息进行查询，可以到抗体网站进行搜索，找到相应抗体后，在抗体详情页面获取目标蛋白的进一步信息：目的蛋白的背景信息，分子量，在细胞中的表达定位等。还有一个关键资料就是该抗体发表的相关文献列表——了解相关蛋白研究的不同方向，结合几家抗体信息，基本可以得到比较全面的目标蛋白资料啦！

在获取目标蛋白的详细资料后，我们还需明确实验目的：为什么要做WB实验？通过WB要验证哪些问题？——验证已知蛋白的表达？或者是进行不同实验干预后，目标蛋白发生了怎样的变化？

在明确目标蛋白信息及实验目的之后，我们就可以进行蛋白提取了。

样品破碎及裂解

为了完全分析细胞内蛋白，样品必须经过有效的破碎——即破坏细胞壁和/或细胞膜，使胞内产物获得更大程度的释放，使得蛋白质溶入已知成分的溶液内，从而获取蛋白质样品。

对于细胞样品而言，裂解液中的去污剂可打破细胞膜磷脂双分子层结构，以获取可溶性蛋白；而对于动物组织、细菌、酵母以及植物等样品，则需要额外的机械或非机械破碎方法（匀浆器、珠磨法、超声波法、反复冻融法、化学法等）才能有效释放蛋白。

注意事项：细胞裂解时会破坏细胞膜和细胞器，导致蛋白水解酶释放，从而降低蛋白产量并影响蛋白功能。为了防止提取的蛋白降解，通常需要在细胞裂解试剂中添加蛋白酶抑制剂，磷酸化相关研究还需加入磷酸酶抑制剂。

蛋白样品除杂

蛋白提取后，蛋白样品通常含有影响蛋白稳定性或与下游应用不兼容的杂质。这些杂质主要包括核酸，脂类，组织碎片等，这些杂质均会干扰下游实验。特别是核酸杂质会增加样品的粘度，可能会引起WB中凝胶孔堵塞，核酸与蛋白结合阻碍聚集，显影背景过高等问题，所以需尽量去除杂质。

传统的提取方法（如RIPA裂解液和溶液法提取的试剂盒）缺少有效的杂质去除步骤，获得的蛋白纯度较低，此外离心取上清弃掉沉淀的步骤也会损失较多蛋白质，从而影响蛋白的提取质量及完整性。

文章使用RIPA提取人结肠癌细胞蛋白，对WB实验中常使用的20种内参进行检测，发现有许多内参被丢失在了不可溶组分中，例如Actin，Tubulin，Lamin A，H3等等。所以有时你检测不到内参，或者内参调整不齐可能是样品制备时蛋白丢失造成的。

而Invent柱式总蛋白提取技术突破了传统方法的困境，不产生沉淀，无需分离上清，而且可以去除基因组核酸干扰，可快速获取高质量的蛋白质样品，降低下游检测难度，提高数据真实性。

分别使用柱式法和RIPA进行小鼠心肌总蛋白的提取，梯度上样，检测H3，Invent提取的样品无蛋白丢失，保持了蛋白的正确比例，更接近于体内的真实情况。

此外若比较目标蛋白在细胞不同组分中表达量或是蛋白定位、转运实验，还会涉及到亚细胞结构的分离，我们将在后续进行详解。

关注

  Invent一直致力于柱式法快速蛋白提取的开发以及打造更全的亚细胞结构分离平台，为您提供更加专业的工具及技术支持。如果您有更多关于蛋白样品制备方面的疑虑，欢迎您随时与我们沟通。