XY性反转雌性小鼠的鉴定和初步分析

原始性腺的分化和生殖细胞的产生是哺乳动物繁殖的基础。哺乳动物性别控制技术的提高依赖于对性腺分化机制的进一步认识，而性腺分化异常引起的繁殖障碍成为动物被淘汰的原因之一。因此，进一步阐明哺乳动物性腺分化和生殖细胞发生的机制，不仅有助于理解生殖发育过程和认识相关疾病的病因，而且对于提高动物性别控制技术和生产效率具有重要的意义。哺乳动物的性别决定和性腺分化是受多种因素调控的复杂过程，主要取决于性染色体，同时常染色体基因也发挥作用，是遗传因素和环境因素共同作用的结果[1-3]。决定睾丸分化的首要基因是由Sinclair等[4]在1990年发现的Sry(sex-determining region Y)基因，其定位于Y染色体短臂末端，邻近伪体染色体区的35 kb内。将小鼠的Sry基因导入XX胚胎后，成功得到了睾丸，实现性反转[5]；而Y染色体上缺失Sry基因片段的小鼠也会发生性反转，得到生育力低下的XYTdym1雌性[6]。最新的研究发现，小鼠Y染色体上只有Sry和Eif2s3y基因对雄性单倍体生殖细胞的发育是必需的，通过辅助繁殖技术能够产生子代小鼠[7]。这些都说明，哺乳动物Y染色体上Sry基因的表达诱导性腺向睾丸分化，从而表现为雄性个体。同时，性反转小鼠(表型与性染色体不符)的产生为研究性染色体功能和性腺分化与生殖细胞发生提供了独特的模型。本实验室从加拿大引进了一种能产生性反转后代的小鼠B6.XYTIR，这种小鼠是1987年于意大利发现的野生突变体，与B6野生型雌性交配后，能同时得到XX雌性、XY雄性、XY性反转雌性小鼠[8]。虽然已经进行了一定的研究工作，但迄今为止，这一小鼠后代发生性反转的原因仍不清楚。基因表达层面的分析发现，与性腺分化和精子发生相关的基因Sry、Sox9和Wnt4在B6.XYTIR性腺(睾丸和卵巢)中均表达[8-11]。进一步研究发现，B6.XYTIR性腺中Sry蛋白的表达晚于野生型B6.XY；即使性腺中只有中心区域存在睾丸结构，Sry蛋白也表达于B6.XYTIR整个性腺中[10]。

本研究进一步确立了B6.XYTIR性反转小鼠的繁育和鉴定方法，同时对胎儿期性腺的分化和Zfy基因的序列进行了初步分析，进一步探讨B6.XYTIR小鼠生殖细胞的发生，及其发生性反转的机制，为性别决定相关研究提供动物模型和理论指导。

B6.XYTIR雄性小鼠由加拿大麦吉尔大学健康中心Teruko Taketo教授赠送；野生型B6小鼠(雌、雄)购自扬州大学比较医学中心。

Anti-Germ cell-specific antigen antibody和Goat Anti-Rat IgG H & L (Alexa FluorⓇ 488) preadsorbed购自Abcam公司；DAPI购自碧云天(Beyotime)生物技术公司；基因组DNA提取试剂盒购自德国Qiagen公司；引物由中国华大基因公司合成；PCR相关试剂购自日本TaKaRa公司；胶回收试剂盒购自中国TIANGEN公司；其他未特别说明的试剂均购自美国Sigma公司。

将B6.XYTIR雄性小鼠(6月龄)与野生型B6雌性小鼠(4月龄)以1:2的比例合笼，自然交配，早晚检查阴道栓，以见到阴道栓为交配成功的标志，并记为0.5 dpc(days post coitum，交配后天数)，同时将野生型B6雌雄鼠合笼交配作为对照；将17.5 dpc孕鼠颈椎脱臼处死，在显微镜下分离胎鼠的性腺；或者待孕鼠分娩后对后代进行外生殖器鉴定，以确定雌雄后代。

将采集的胎鼠性腺置于4%多聚甲醛中固定2 h后，用10%~30%蔗糖对其脱水处理3 h，将性腺转移至0.5%的TritonX-100透膜液中处理12 h，用含1%BSA的PBS室温封闭1 h；添加一抗(TRA98；1:500稀释)孵育2 d；用0.1%的TritonX-100清洗3次；添加二抗(山羊抗大鼠AFⓇ488；1:500稀释)孵育1 d；清洗后用DAPI(1:500稀释)孵育过夜；用透明液(含24%尿素、10%甘油、0.5%的TritonX-100)处理性腺至透明；激光共聚焦显微镜扫描拍照。

采集胎鼠的部分肝和出生后小鼠的部分耳组织，用基因组DNA提取试剂盒提取DNA，具体操作步骤按照试剂盒说明书完成。依据NCBI(GenBank)中小鼠Zfy-1(Gene ID：22767)和Zfy-2(Gene ID：22768)的DNA序列设计通用引物，上游引物序列为:5′-AAGA-TAAGCTTACATAATCACATGGA-3′，下游引物序列为:5′-CCTATGAAATCCTTTGCTGCACATGT-3′。所有的PCR体系包含0.4 mmol·L-1引物、0.2 mmol·L-1 dNTPs、50 mmol·L-1 KCl、10 mmol·L-1 Tris-HCl(pH 8.3)、1.5 mmol·L-1 MgCl2和1.25 U的rTaq hotstart聚合酶。所有PCR在ABI 9700上运行。PCR扩增的程序：94 ℃预变性10 min；94 ℃变性15 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸30 s，35个循环；72 ℃延伸10 min。PCR扩增所得的产物经琼脂糖凝胶电泳检测，切胶后用胶回收试剂盒纯化回收；纯化片段克隆入PMD-19T载体，经PCR鉴定阳性后的克隆送中国华大基因公司测序。

将B6.XYTIR雄鼠和野生型B6雄鼠分别与野生型B6雌性小鼠合笼自然交配，取出生后不同日龄小鼠，通过观察其肛殖距和是否有阴道口等特征来分辨性别表型，通过PCR扩增Zfy基因鉴定基因型，结果如图 1所示。从图 1A可见，野生型小鼠(WT)在出生后30日龄(30 d)已逐渐出现两性特征，如雄鼠(#1)的肛殖距明显大于雌鼠(#2)，雌鼠可观察到雄性没有的阴道口；且随着日龄的增大，雌雄鼠间的差异越明显(60、90 d)。Zfy基因是Y染色体上的特有基因，通过Zfy基因的存在与否来判断其XX或XY基因型。从图 1B可见，电泳条带清晰无杂带，位于500和700 bp之间，符合预期分子量大小(618 bp)。野生型B6雄鼠能扩增到Zfy基因，而野生型B6雌鼠则扩增不到Zfy基因(图 1B)。在B6.XYTIR雄鼠后代中，除了和野生型后代一致的雌性和雄性小鼠外，有性反转小鼠(#3)的存在，其表现为肛殖距与野生型B6雌性相一致，但基因型为XY(能扩增到Zfy基因)，而且这种性反转并不会因为日龄的增长而消失(60、90 d)。

取出生以后小鼠，对其进行基因型和表型鉴定后，颈椎脱臼处死，显微镜下仔细剥离内生殖系统，拍照记录，结果如图 2所示。野生型雄性小鼠内生殖系统主要由睾丸、附睾、输精管和精囊腺组成，野生型雌性小鼠内生殖系统主要由卵巢、输卵管和子宫组成。B6.XYTIR的XY后代中存在雌雄同体，外观(外生殖器)表现为雄性，但同时拥有雄性和雌性生殖系统，即一侧为卵巢、输卵管和子宫，另一侧为睾丸、附睾和输精管。野生型雌性拥有完整的雌性生殖系统，而B6.XYTIR的XY雌性后代同样拥有完整的雌性生殖系统。

将B6.XYTIR雄性小鼠与野生型B6雌性小鼠合笼自然交配，取17.5 dpc胎鼠肝组织，通过PCR扩增Zfy基因确定其基因型，利用Tra98特异性标记生殖细胞，通过免疫荧光染色观察性腺中生殖细胞分布情况，结果如图 3所示。从图 3A可见，在野生型XY雄性胎鼠性腺(WT testis)中，生殖细胞呈管状分布，在野生型XX雌性胎鼠性腺(WT ovary)中，生殖细胞呈均匀分布；而在B6.XYTIR后代胎鼠XY性腺中，既有与野生型XY类似的管状分布(TIR testis)，也有与野生型XX类似的均匀分布(TIR ovary)。这说明B6.XYTIR后代中性反转的发生在胎鼠性腺发育过程中已经存在。

Y染色体上Zfy基因包括Zfy-1和Zfy-2，NCBI序列分析显示，二者同源性为99%，最大的区别是，与Zfy-1相比Zfy-2基因存在一个18 bp的碱基缺失区(图 4A)。本研究依据GenBank中小鼠Zfy-1和Zfy-2基因保守区设计通用引物，能同时扩增Zfy-1和Zfy-2并包含18 bp的碱基缺失区，但是二者的区分只能通过测序进行。测序结果显示(图 4B)，野生型B6雄鼠中(WT male)同时存在Zfy-1和Zfy-2，而在B6.XYTIR的XY后代(17.5 dpc、30 d、60 d、90 d)中，不管表型是雄性(TIR male)还是雌性(TIR female)，均只有Zfy-1的基因，而未能扩增到Zfy-2基因。这说明B6.XYTIR的Y染色体上可能缺失Zfy-2基因。

本研究统计了B6.XYTIR后代中XY雌鼠在所有XY小鼠(99只)中所占的比例，如表 1所示，结果显示，性反转率为47.47%。后代中XYTIR雄性可以继续繁殖并得到性反转小鼠。

性腺分化机制和性染色体功能的研究对于哺乳动物繁殖技术的提高具有重要的指导意义。本研究中性反转小鼠的鉴定和初步分析对于进一步研究性腺分化和生殖细胞发生机制奠定了基础。

断奶后小鼠随着两性特征的出现，可以根据其外生殖器特征如肛殖距来分辨性别表型[12-13]，但出生前小鼠胎儿无法直观地判断其性别表型，因此，只能通过其性腺甚至生殖细胞的特征来辨别。大约在胚胎发育至10.5 dpc时，性腺开始逐渐向卵巢或睾丸分化，睾丸支持细胞出现以后向生殖细胞靠近，最终将生殖细胞包裹形成曲精小管(生精小管)，此时生殖细胞排列呈条管状[14]。本研究在形态学上观察性腺，并用Tra98标记性腺中生殖细胞的方法，可以直观地看到性腺的形态及生殖细胞在性腺中的分布情况，从而可以准确判断胎鼠的性腺表型。本研究通过标记17.5 dpc胎鼠生殖细胞，结果发现，XYTIR胎鼠性腺既有与野生型雌性相似，也有与野生型雄性相似的生殖细胞分布类型，这说明性反转在胎鼠性腺发育过程中即已存在，但由于17.5 dpc以下准确胎龄的B6.XYTIR胎鼠较难获取，在更早时期是否发生性反转尚待进一步研究证实。

哺乳动物的性别决定和性腺分化是一个受多种因素调控的复杂过程，主要取决于性染色体，同时常染色体基因和一些非编码RNA(如IncRNA、miRNA、piRNA等)也发挥作用，是遗传因素和环境因素共同作用的结果[1-3, 15-16]。与哺乳动物性腺分化机制不同的是，一些啮齿类动物和鱼类的性腺分化是完全依赖于环境因素的，例如温度[17-18]；而且性逆转之后仍然能够产生功能正常的生殖细胞[19]。进一步的研究表明，表观遗传修饰(DNA甲基化和组蛋白修饰)在温度决定性腺分化中发挥关键作用[20-21]。虽然哺乳动物的性腺分化是遗传(染色体)决定的，但环境因素也发挥一定的作用；表观遗传修饰在哺乳动物性腺分化中也具有作用[22-23]。B6.XYTIR雄性小鼠与野生型B6雌性小鼠自然交配后，部分后代呈现XY(XYTIR)雌性性反转表型，总的发生率(性反转率)为47.47%，而且后代中XYTIR雄性可以继续繁殖并得到性反转小鼠。与其他基因操作所造成性逆转小鼠所不同的是，B6.XYTIR小鼠的后代中，同一基因型(XY)中雄性和雌性的比例是相当的，并非全部的XY都出现性逆转；这表明完全相同的基因组出现了两种完全不同的表型，且概率相当。可见，表观遗传机制发挥作用可能是XYTIR小鼠出现性反转的原因之一。

Zfy基因曾因作为睾丸决定因子的候选基因而备受关注[24-25]，但很快受到质疑而被排除[26-27]。最早的研究发现，Y染色体短臂1A2区携带的一个基因可能与睾丸决定相关，被认为是睾丸决定因子(testis determining factor，TDF)的候选基因，核苷酸序列分析发现其编码锌指蛋白(至少有13个锌指域)[25]。但是，后续的发现否定了这一猜测。因为，在一些XX雄性和XX雌雄同体的个体中缺少Y染色体的1A2区；而在XY雌性个体中检测到了Y染色体上完整的1A2区，这说明Y染色体1A2区并不直接决定性腺向睾丸的分化。因此，Y染色体上1A2区编码锌指蛋白的基因被重新命名为Zfy(Y-linked zinc-finger protein)基因，包括Zfy-1和Zfy-2[24]。在之后的研究中发现，Zfy基因即使不能作为睾丸决定因子，但可产生一种保守的睾丸特异性转录本，编码的锌指蛋白具有短酸性结构域和反式激活潜能[28]。Zfy-1和Zfy-2在减数分裂粗线期发挥生精功能，在第一次减数分裂中期通过触发精细胞凋亡消除，促进第二次减数分裂[29]。即便如此，Zfy基因仍被广泛应用于XX和XY基因型的鉴定。例如，同时扩增Zfy和Zfx基因可以鉴定牛胚胎的性别，也可以用于林麝和绒山羊的性别鉴定，准确率均达到99%以上[30-31]。

有研究提出，利用RNA干扰技术调控Zfy和Zfx基因的表达可以控制动物后代的性别[32]。这说明Zfy基因即便不是睾丸决定基因，也肯定参与了动物性别表型的调控。本研究利用PCR扩增Zfy基因来鉴定小鼠基因型；同时测序结果表明，扩增产物与GenBank中公布的Zfy-1基因相似性为99.1%，证明了扩增Zfy基因鉴定小鼠或胎鼠基因型的方法有效。然而，与野生型XY雄性相比，B6.XYTIR雄性和雌性中均只检测到Zfy-1基因，未能检测到Zfy-2基因；这说明Zfy基因的异常可能与XYTIR性反转的机制有关联。B6.XYTIR小鼠具有完整的Y染色体，且雄性和雌性的概率相当，是一种特殊的性反转模型，由于目前对B6.XYTIR小鼠的研究较少，其原因尚待进一步探讨。

本研究成功繁育并鉴定了XY雌性性反转小鼠。对出生后小鼠的研究表明，XY雌性小鼠拥有一套完整的雌性生殖系统；对胎鼠性腺的研究结果表明，性反转在胚胎时期即已发生，初步研究表明，Zfy基因与性反转的发生有联系；该结果可为进一步研究性腺分化和生殖细胞的发生提供新思路。